《Plant Communications》：The Medicago SPX1/3-PHR2 Network Relays Phosphate Signaling to Orchestrate Root Nodulation-dependent Nitrogen Acquisition by Controlling Flavonoid Biosynthesis
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本研究针对植物如何平衡微生物介导的氮(N)磷(P)吸收这一关键科学问题，聚焦于豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的磷信号调控网络。研究人员发现，磷酸盐感受器SPX1/SPX3及其互作转录因子PHR2通过直接调控类黄酮(flavonoid)生物合成基因的表达，进而影响根际氮固定微生物的招募和根瘤共生效率。在低磷条件下，PHR2抑制类黄酮合成，减少根瘤形成以维持N/P平衡；而在高磷条件下，SPX1/3与PHR2的相互作用解除其对类黄酮合成的抑制，促进根瘤共生和氮获取。该研究揭示了SPX-PHR网络在协调微生物依赖的氮磷营养平衡中的新功能，为理解植物-微生物互作的营养调控机制提供了重要见解。
在自然界中，植物作为固着生物，其生长和生存严重依赖于从土壤中获取必需的营养元素。氮(N)和磷(P)是限制植物生长发育的两个最重要的常量营养元素。为了应对氮磷缺乏的胁迫，植物进化出了多种适应性策略，包括改变自身基因表达模式以提高营养利用效率，以及与土壤中的微生物建立共生关系。其中，豆科植物与根瘤菌形成的根瘤共生体系，是自然界中最具代表性的生物固氮系统之一，能够将大气中的氮气转化为植物可利用的氮素。与此同时，丛枝菌根真菌共生则能极大地帮助植物吸收磷素。然而，一个核心的科学问题始终困扰着研究者：植物如何精确地感知自身的氮磷营养状况，并相应地调控这些微生物共生关系的建立与维持，从而实现氮磷吸收的最佳平衡？这不仅关系到植物的生长发育，也对农业可持续发展至关重要。
以往的研究表明，植物根系分泌的化学物质，即根分泌物，在塑造根际微生物群落结构中扮演着关键角色。类黄酮(flavonoids)作为一类重要的植物次生代谢产物，已被广泛证实是豆科植物招募根瘤菌、启动根瘤共生的关键信号分子。另一方面，植物体内的磷信号调控网络核心组分——SPX结构域蛋白和PHR (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE)转录因子，被熟知的功能是在不同磷水平下调控磷饥饿响应基因的表达，以维持磷稳态。但这两个看似独立系统之间是否存在交叉对话？磷信号是否以及如何通过调控类黄酮的合成来影响根瘤共生和氮获取？这成为了本研究试图解答的谜题。
为了回答上述问题，研究人员以豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)为材料，聚焦于其磷信号通路中的关键组分SPX1、SPX3和PHR2。本研究综合利用了植物生理学、分子生物学、微生物组学、转录组学、代谢组学等多种技术手段。关键实验技术包括：利用spx1spx3双突变体和phr2突变体进行表型分析（生物量、氮磷含量测定）；通过宏基因组测序分析根际微生物群落组成；采用RNA-seq技术分析根系基因表达谱；利用LC-MS/MS进行根系分泌物的非靶向代谢组学分析；通过根瘤共生实验（接种带GFP标记的苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 2011）统计侵染线和根瘤数；运用农杆菌介导的毛根转化技术进行基因功能验证；通过酵母单杂交实验验证转录因子与靶基因启动子的直接结合作用。
SPX1和SPX3促进苜蓿生长并招募固氮微生物
研究人员首先比较了野生型R108和spx1spx3双突变体在自然土壤（含微生物）和灭菌土壤条件下的生长情况。结果表明，无论是野生型还是突变体，在自然土壤中的生长均优于灭菌土壤，证实了微生物对植物生长的促进作用。更重要的是，spx1spx3双突变体的生长差于野生型，且这种差异在灭菌土壤中更为显著，暗示SPX1和SPX3可能通过招募有益的根际微生物来部分促进植物生长。对植株氮磷含量的测定发现，在自然土壤中，野生型R108地上部的氮磷含量均显著高于spx1spx3突变体，根系氮含量也更高，但磷含量差异不显著。这表明SPX1和SPX3招募的微生物可能更倾向于促进植物的氮素吸收。
为了探究究竟是哪些微生物被SPX1和SPX3所招募，研究人员对野生型和突变体的根际微生物组进行了宏基因组测序分析。虽然两者根际微生物的Alpha多样性（物种丰富度和均匀度）没有显著差异，但Beta多样性分析（PCoA）显示它们的微生物群落结构存在明显分离。进一步分析发现，在野生型R108的根际，具有固氮能力的伯克霍尔德菌属(Burkholderia)和副伯克霍尔德菌属(Paraburkholderia)的相对丰度显著高于突变体。线性判别分析（LEfSe）也确认，多个伯克霍尔德菌属的固氮物种以及一种根瘤菌(Rhizobium rosettiformans)在野生型根际显著富集。功能基因分析进一步揭示，与氮代谢相关的通路，特别是固氮模块的基因，在野生型样本中更为丰富。这些结果清晰地表明，SPX1和SPX3能够特异性地招募富含固氮功能的微生物群落到根际，从而为宿主植物创造更有利的氮素吸收环境。
SPX1和SPX3通过调控类黄酮生物合成影响根瘤共生
那么，SPX1和SPX3是如何影响根际微生物组成的呢？通过对野生型和spx1spx3双突变体根系进行转录组测序（RNA-seq），研究人员发现，在突变体中下调表达的基因显著富集在类黄酮生物合成及相关代谢途径上，例如苯丙烷生物合成、查尔酮生物合成、柚皮素-查尔酮生物合成等。许多关键的类黄酮合成基因，如查尔酮合成酶1 (chalcone synthase 1)、柚皮素-查尔酮合成酶 (naringenin-chalcone synthase)、2-羟基异黄酮脱水酶 (2-hydroxyisoflavanone dehydratase)等在突变体中的表达量均显著降低。这一发现在自然土壤条件下通过qRT-PCR得到了验证。
紧接着，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对根系分泌物进行非靶向代谢组学分析，研究人员从化学物质层面证实了上述推论。在spx1spx3突变体的根系分泌物中，共有168种代谢物存在显著差异，其中143种是下调的。KEGG富集分析再次指向了异黄酮生物合成和类黄酮生物合成通路。具体而言，一些已知在根瘤共生中起关键作用的黄酮（如7,4'-二羟基黄酮、木犀草素）和异黄酮（如芒柄花素、染料木素）在突变体中的含量显著低于野生型。这些结果确凿地证明，SPX1和SPX3的缺失损害了类黄酮的生物合成，并减少了其向根际的分泌。
鉴于类黄酮在豆科植物-根瘤菌共生建立中的核心作用，研究人员进一步探究了SPX1和SPX3对根瘤形成的影响。在高磷条件下接种带GFP标记的苜蓿中华根瘤菌后，发现spx1spx3突变体的根瘤侵染线数量和最终形成的根瘤数量均显著少于野生型。在自然土壤条件下的接种实验也观察到了类似趋势。更为重要的是，当外源施加在突变体中分泌减少的关键黄酮（7,4'-二羟基黄酮）和异黄酮（染料木素）时，能够部分回补突变体在根瘤形成方面的缺陷，植株的生长和氮含量也得到部分恢复。这表明，SPX1和SPX3正是通过调控类黄酮的合成来正向调控根瘤共生。值得注意的是，外源添加类黄酮并不能完全回补表型，提示还有其他受SPX1/3调控的化学物质也参与其中。
PHR2是SPX1/3下游调控类黄酮合成和根瘤共生的关键因子
SPX蛋白通常与PHR转录因子互作来传递磷信号。那么，SPX1和SPX3是否通过其互作蛋白PHR2来调控类黄酮合成呢？研究人员分析了之前获得的phr2突变体的转录组数据，发现与spx1spx3突变体相反，在phr2突变体中，类黄酮生物合成相关基因的表达反而上调了。这提示PHR2可能扮演着抑制类黄酮合成的角色。
为了验证这一假设，研究人员在苜蓿毛根中过表达了PHR2、SPX1、SPX3以及PHR2与SPX1或SPX3的融合蛋白。结果发现，单独过表达PHR2会抑制多个类黄酮合成基因（如类黄酮糖基转移酶、异黄酮-7-O-甲基转移酶、查尔酮合成酶家族蛋白基因）的表达；而单独过表达SPX1或SPX3则能增强这些基因的表达；当共表达PHR2-SPX1或PHR2-SPX3时，PHR2的抑制作用被减弱或消除。这表明SPX1/3能够拮抗PHR2对类黄酮合成基因的抑制。进一步的酵母单杂交实验证明，PHR2能够直接结合到上述类黄酮合成基因的启动子区域，从而直接抑制其转录。
最后，研究人员检测了phr2突变体的根瘤共生表型。在低磷条件下，phr2突变体的侵染线和根瘤数量均显著多于野生型；然而，在高磷条件下，情况却发生了逆转，phr2突变体的侵染线和根瘤数量反而略低于野生型。这一看似矛盾的结果恰恰揭示了PHR2功能的磷依赖性：在低磷时，PHR2抑制根瘤共生；在高磷时，则促进根瘤共生。而SPX1/3正是通过在不同磷水平下与PHR2发生不同强度的相互作用，来精细调控PHR2的活性，进而影响类黄酮合成和根瘤共生。
研究结论与意义
综上所述，本研究揭示了蒺藜苜蓿中磷稳态调控网络SPX1/3-PHR2的一个新颖功能：通过调控类黄酮生物合成来协调根瘤依赖的氮获取，从而维持微生物介导的氮磷营养平衡。研究者提出了一个工作模型：在低磷条件下，SPX1/3与PHR2的相互作用较弱，PHR2得以自由地结合到类黄酮生物合成基因的启动子上，抑制其表达，从而减少类黄酮分泌和根瘤形成，限制氮的过量吸收以维持体内N/P平衡。在高磷条件下，SPX1/3与PHR2发生强烈相互作用，抑制了PHR2的DNA结合活性，从而解除其对类黄酮合成的抑制，促进类黄酮分泌、根瘤菌招募和根瘤形成，增强氮获取以满足植物生长需求。
该研究的创新性在于首次将植物的磷信号通路核心组分SPX-PHR网络与调控根分泌物（类黄酮）和根际微生物群落（特别是固氮微生物）联系起来，阐明了植物整合氮磷营养信号、协调不同微生物共生途径的一种内在机制。这不仅深化了我们对植物-微生物互作分子机制的理解，也为未来通过遗传手段改良作物养分利用效率、减少化肥依赖提供了重要的理论依据和潜在的基因资源。相关研究成果发表在植物科学领域知名期刊《Plant Communications》上。
