《Aquatic Toxicology》：Zebrafish Abcg2a mutant line as an
in vivo model for evaluation of the interaction of Abcg2a with drugs and contaminants
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ABC转运蛋白在生物体中起到转运和解毒的关键作用，本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建zebrafish Abcg2a突变体，验证其作为毒理学和药理学模型的可靠性。突变体在胚胎发育至成体阶段均未出现表型异常，但基因表达量下降超90%，荧光底物pheophorbide A的分布模式与野生型存在显著差异。在MLN7243和mitoxantrone毒性测试中，突变体幼鱼存活率显著降低，且加入抑制剂Ko143后野生型幼鱼死亡率与突变体相当，证实Abcg2a对药物和毒物转运的必要性。
Jovica Lon?ar | Roko ?aja | Ivan Mihaljevi? | Jelena Dragojevi? Vi?evi? | Lana Vujica | Marin Kutnjak | Cecile Otten | Tvrtko Smital
分子生态毒理学实验室，鲁杰尔·博斯科维奇研究所（Rudjer Bo?kovi? Institute）海洋与环境研究部门，地址：Bijeni?ka 54，10000，萨格勒布，克罗地亚
摘要
作为ABC转运蛋白超家族的成员，ABCG2是一种半转运蛋白，能够介导各种外源性底物穿过细胞膜的过程，在细胞解毒中起着关键作用。为了开发一个可靠的体内模型来研究ABCG2及其与药物和环境污染物之间的相互作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建了一种斑马鱼（Danio rerio）的Abcg2a突变体品系。这些Abcg2a突变体能够正常发育至成年，且没有可见的表型变化。在受精后5天内，突变体幼鱼的abcg2a基因表达减少了90%以上，并且在监测的8个基因中有3个基因的功能相关转录本表达增加。特定荧光底物pheophorbide A在突变体和野生型之间的积累模式有所不同，突变体主要在胆囊中积累，而野生型主要在肠道中积累。当暴露于模型毒素MLN7243和mitoxantrone时，突变体幼鱼的死亡率高于野生型。添加特定抑制剂Ko143后，野生型幼鱼的死亡率上升至与突变体相同，表明Abcg2a的保护作用被消除。所创建的Abcg2a突变体品系可作为药理学和生态毒理学中的可靠体内模型，进一步阐明Abcg2a在不同组织和细胞区室中的功能及其与不同生理或外源性化合物的相互作用。
引言
ATP结合盒（ABC）膜转运蛋白存在于动物组织中，这些组织构成了吸收的外界（皮肤）或内部边界（肠道）、参与排泄的组织（肝脏、肾脏），或是血-组织屏障（血-脑、血-睾丸、血-胎盘屏障）。在这些部位，它们限制了外源性物质的进入和分布，并参与其排泄。人类中的ABC转运蛋白家族包含48个成员，分为7个亚家族。参与转运外源性物质、药物和环境污染物的成员蛋白属于B、C和G亚家族。所有成员都至少具有一个核苷酸结合域（NBD），并根据NBD的序列保守性进行分类（Annilo等人，2006年）。B亚家族的转运蛋白含有两个NBD和两个跨膜结构域（TMD），因此是完整的转运蛋白；C亚家族的一些转运蛋白还包含一个额外的TMD；G亚家族的转运蛋白仅含有一个NBD和一个TMD，以N'-C'方向排列，属于半转运蛋白（Sarkadi等人，2020年；Dean等人，2022年）。
ABC转运蛋白具有广泛的底物选择性，并且底物之间存在较高的重叠性。一般来说，ABCB1（通透性糖蛋白，P-gp）转运不带电荷且呈中性的两亲性化合物；ABCC1-C3（多药耐药相关蛋白，MRPs）转运有机阴离子，包括与谷胱甘肽（GSH）结合的生物转化代谢物、葡萄糖醛酸和硫酸盐。然而，ABCG2转运蛋白（乳腺癌耐药蛋白，BCRP）能够转运ABCB1和ABCC的底物。ABCG2的底物包括蒽环类药物（如多柔比星）、蒽醌类药物（如mitoxantrone）、表鬼臼毒素（如etoposide）、酪氨酸激酶抑制剂（如imatinib、sunitinib和nilotinib）、叶绿素降解产物（如pheophorbide A，PhA）、喹啉生物碱（如topotecan和irinotecan），以及生理底物（如卟啉前体、尿酸盐、类固醇（胆固醇、E3S）和叶酸）。与大多数同时被ABCB1和ABCC1-3转运的化合物不同，PhA已被证明是ABCG2的特异性底物。因此，开发了一种荧光测定方法用于体外（Robey等人，2004年）和体内（Yasuda等人，2018年）检测ABCG2的活性。
目前，关于ABC转运蛋白在脊椎动物和无脊椎动物中保护作用的大部分证据都支持ABCB1、ABCC1-3和ABCG2的作用，这些转运蛋白已在原代细胞培养和癌细胞系中显示出对外源性物质的转运能力。此外，还使用了各种野生型（WT）和突变体模型生物（小鼠、大鼠、鱼类）进行了体内研究。此外，位于肝细胞和肠上皮细胞顶端的ABCB11转运蛋白并未直接参与外源性物质的清除，但它对胆汁分泌和肠肝循环过程至关重要，而这些过程对某些ABCG2底物的分布和清除至关重要（Henkel等人，2013年；Nayagam等人，2020年；Bieczynski等人，2021年）。
与哺乳动物相比，硬骨鱼类经历了整个基因组的额外复制，因此它们通常拥有多个在人类中仅以单个基因形式存在的基因。ABCG2在鳟鱼中有两个同源基因（Abcg2a和d），而在斑马鱼中有四个（Abcg2a、b、c和d）。研究表明，Abcg2a在鳟鱼（Zaja等人，2016年）和斑马鱼（Thomas等人，2024b）中都是人类ABCG2的功能性同源物，并且在血-脑屏障中的定位也相似。
也观察到了一些基因的丢失，例如ABCB1在斑马鱼中不存在，其功能由abcb4和部分由abcb5承担（Fischer等人，2013年）。尽管存在上述差异，斑马鱼仍拥有超过70%的人类ABC转运蛋白的同源基因，再加上其他特性（如体型小、繁殖能力强、发育迅速和胚胎透明），使其成为研究膜转运蛋白功能的理想模型，无论是在生物医学药物研究还是环境毒理学领域（Ferreira等人，2014年；Luckenbach等人，2014年；Hotz等人，2021年；Thomas等人，2024a）。
鱼类中ABC转运蛋白的功能已在体内（胚胎、幼鱼、成鱼）和各种体外模型（原代细胞培养、细胞系、分离的肾近端小管、分离的脑毛细血管、膜囊泡）中得到研究。然而，使用鱼胚胎进行的形态学敲低研究相对较少（Fischer等人，2013年），并且开发的突变体鱼品系也非常有限（Park等人，2023年；Ellis等人，2018年；Tian等人，2017年；Pham等人，2021年）。为了解决这一研究空白，本研究重点开发并表征了一种缺乏ABCG2转运蛋白功能同源物的斑马鱼突变体品系，该转运蛋白参与内源性和外源性物质的转运，在脊椎动物和无脊椎动物中在分子结构和功能上都具有进化保守性（Robey等人，2009年；Sarkadi等人，2020年；Dean等人，2022年；Thomas等人，2024b）。
由于Abcg2a的序列同源性最高（61%），且在功能上与人类ABCG2最为相似（Thomas等人，2024b），本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建并表征了一种斑马鱼突变体品系。人类和斑马鱼的ABCG2/Abcg2a同源物在胃肠道和血-脑屏障中均高度表达，能够降低外源性物质的生物利用度和分布，因此推测Abcg2a突变体在接触外来化学物质时会更敏感。这些突变体能够正常发育至成年，且没有可见的表型变化。在突变体幼鱼中，abcg2基因的表达减少了90%以上，大多数相关基因的转录也受到抑制，且野生型与突变体幼鱼在特定荧光底物的转运方面存在显著差异。此外，暴露于模型毒素MLN7243和mitoxantrone时，突变体幼鱼的死亡率增加，而添加特定抑制剂Ko143后，野生型幼鱼的死亡率上升至与突变体相同。
伦理声明
本研究获得了鲁杰尔·博斯科维奇研究所伦理委员会、克罗地亚萨格勒布国家动物福利委员会和农业部的批准（批准编号525-10/124,120–9），并遵循了2010年9月欧洲议会和理事会关于用于科学目的的动物保护的指令（2010/63/EU）进行。
化学品
所有化学品均购自Sigma–Aldrich（德国Taufkirchen）或Alfa Aesar（美国马萨诸塞州Ward Hill）
Abcg2a突变斑马鱼品系的生成与验证
我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对abcg2a基因的第4外显子（ENSDARG00000100075）设计了gRNA，从而生成了含有移码突变的斑马鱼Abcg2a突变体品系（图1A和1B），该突变导致无义密码子和翻译提前终止（图1B）。通过测序确认了F3代中abcg2a突变体的成功生成，结果显示abcg2a基因组位置14512–14513处有两个核苷酸（TC）缺失。
讨论
由于脊椎动物的基因通常具有高度保守性（Chan等人，2009年），且斑马鱼胚胎发育迅速（Kimmel等人，1995年），因此它们被广泛用于生物医学（Goldsmith和Jobin，2012年；Anticevic等人，2023年）和生态毒理学（Fan等人，2021年；Vujica等人，2024年）领域，因为它们允许对具有功能性器官的胚胎进行中等（Bieczynski等人，2020年；Gong等人，2025年）和高通量（Spomer等人，2012年；Grasse等人，2024年）的化学物质筛选。斑马鱼
CRediT作者贡献声明
J. Lon?ar：概念化、数据整理、数据分析、研究方法、验证、撰写——初稿。R. ?aja：概念化、研究方法、撰写——审阅与编辑。I. Mihaljevi?：数据整理、数据分析、撰写——初稿。J. Dragojevi?：数据整理、数据分析、研究方法。L. Vujica：数据整理、数据分析、研究方法、撰写——审阅与编辑。M. Kutnjak：数据整理、数据分析、研究方法。
未引用的参考文献
(Mao和Unadkat，2015年；Schulz等人，2023年；van Wijk等人，2019年；White等人，2017年)
CRediT作者贡献声明
Jovica Lon?ar：撰写——初稿、验证、研究方法、数据分析、概念化。
Roko ?aja：撰写——审阅与编辑、研究方法、概念化。
Ivan Mihaljevi?：撰写——初稿、数据分析。
Jelena Dragojevi? Vi?evi?：研究方法、数据分析。
Lana Vujica：撰写——审阅与编辑、研究方法、数据分析。
Marin Kutnjak：撰写——初稿
