《Bioactive Materials》：Construction of biomimetic gradient-structured cartilage organoids and mechanistic study of their application for cartilage rejuvenation
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本研究针对关节软骨损伤修复中衰老微环境抑制软骨细胞再生能力的难题，开发了一种负载SOX9过表达骨髓间充质干细胞来源细胞外囊泡(SBEVs)的脱细胞软骨基质(dCSEV)水凝胶，并构建了仿生梯度结构软骨类器官(BGSC-organoids)。该体系成功模拟了软骨发育微环境，通过单细胞测序揭示了CPC-ProC分化轨迹在软骨细胞年轻化中的关键作用，并利用骨关节炎芯片(OAOC)模型证实BGSC-organoids通过Vimentin/14-3-3/FOXO3通路增强机械抗性。动物实验表明BGSC-organoids可有效延缓关节软骨和椎间盘退变，为关节再生提供了新策略。研究成果发表于《Bioactive Materials》。
关节软骨损伤是导致骨关节炎(OA)的重要原因，但由于软骨组织缺乏血管和神经分布，且软骨细胞自我修复能力有限，使得软骨修复成为全球性的临床难题。特别是在软骨修复过程中，关节的衰老微环境会抑制软骨形成特性，导致修复失败。传统的二维(2D)单层培养无法模拟天然软骨的生化线索、物理条件以及细胞-细胞和细胞-基质相互作用，而软骨细胞在二维扩增过程中的有限可获得性和表型丢失也限制了它们在大规模组织工程中的应用。
为了解决这些挑战，上海交通大学医学院附属瑞金医院的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了一项创新性研究。他们成功构建了一种仿生梯度结构软骨类器官(BGSC-organoids)培养系统，该系统能够模拟软骨生态位的生物学特征，并实现衰老软骨细胞的年轻化。
为开展本研究，研究人员主要运用了几项关键技术：利用来自老年患者软骨组织的软骨细胞，结合微流控液滴技术构建BGSC-organoids；采用单细胞RNA测序(scRNA-Seq)分析类器官内的细胞异质性和分化轨迹；通过三维电纺丝生物打印技术制造骨关节炎芯片(OAOC)模型，模拟关节囊的机械微环境；使用蛋白质印迹、免疫荧光染色等技术验证关键信号通路。
研究结果
1. dCSEV水凝胶促进人软骨细胞的年轻化
研究人员首先构建了由SOX9过表达外泌体(SEV)和脱细胞软骨基质(dCEM)水凝胶组成的dCSEV水凝胶，以模拟软骨特异性基质微环境。实验结果表明，SBEVs能够与软骨细胞膜融合，促进生物活性剂释放到细胞内。与未处理组相比，SBEV处理组诱导了衰老软骨细胞的年轻化，并增加了软骨细胞特异性标志物(SOX9、CoLII和ACAN)的表达。三维dCSEV重编程系统显著降低了衰老软骨细胞的比例，并通过增加SOX9和ACAN表达促进了年轻化。
2. 仿生梯度结构软骨类器官(BGSC-organoids)恢复软骨发育生态位并诱导软骨细胞年轻化
通过微流控液滴方法制备BGSC-organoids，将软骨细胞封装在dCSEV水凝胶中。培养28天后，大部分软骨细胞在整个类器官中保持活力。BGSC-organoids的平均直径为682.837±97.386μm，而软骨细胞球体的平均直径为571.323±50.018μm。BGSC-organoids中的细胞数量从第1天的初始计数增加了76.74±10.95倍，是球体模型观察到的40.46±3.55倍扩增的1.90倍。制备的BGSC-organoids的杨氏模量(刚度)值与体内软骨组织密切匹配，这可能是它们具有相似生理功能的原因。
组织学染色和扫描电镜分析证实了类器官与软骨组织在胶原沉积和基质结构方面的相似性。免疫荧光染色进一步显示，BGSC-organoids能够诱导软骨表型的维持和软骨微结构的发育。BGSC-organoid培养系统中的细胞表现出与软骨组织更相似的聚类模式。蛋白质释放实验和相关模型预测也验证了BGSC-organoids内部软骨细胞的分泌蛋白产量大于球体模型。
3. 单细胞转录组分析揭示BGSC-organoids在软骨仿生基质微环境中促进软骨细胞年轻化和表型变化
scRNA-Seq分析揭示了三个组中的八个不同细胞簇：软骨祖细胞(CPC)、增殖性软骨细胞(ProC)、增殖效应软骨细胞(ProEC)、稳态软骨细胞(HomC)、前纤维软骨细胞(PreFC)、肥大软骨细胞(HTC)、调节性软骨细胞(RegC)和成纤维软骨细胞(FC)簇。聚类比例分析显示，三维培养，特别是BGSC-organoid培养，显著增加了CPC和ProC簇的比例，降低了FC和RegC簇的比例。
伪时间轨迹分析确定了软骨细胞的四个分化路径：CPC-ProC；CPC-ProEC-RegC；CPC-ProEC-HomC-HTC；以及CPC-ProEC-HomC-PreFC-FC。BGSC-organoids在CPC-ProC分化轨迹上的细胞比例显著增加。基因本体论分析表明，沿CPC-ProC轨迹上调的基因与细胞外基质组织和ECM-受体相互作用显著相关。CellChat分析显示，ECM-受体相互作用，特别是涉及胶原的相互作用，在CPC-ProC分化途径中占主导地位。
4. 软骨生态位启发的三维生物打印骨关节炎芯片(OAOC)可模拟体内软骨微环境
通过将三维打印的软骨支架整合到具有循环机械刺激的微流体平台中，构建了OAOC系统。研究人员利用四种不同的条件模拟生理和OA相关的病理状态。结果表明，生理条件(0.4 MPa)增加了细胞活力和软骨特异性基因标志物SOX9和COL2A1的表达，而病理条件(0.8 MPa联合IL-1β处理)显著降低了细胞活力和典型OA标志物的表达。特别是软骨降解酶MMP3和MMP13以及促炎细胞因子的表达增加。
5. BGSC-organoids在体外表现出良好的机械抗性和软骨保护因子的持续释放特性
在OAOC系统中评估三维软骨类器官的生理功能及其治疗潜力。与细胞球体和类器官治疗组相比，类器官治疗组表现出更高的细胞活力、增殖和软骨特异性标志物表达。BGSC-organoid组活细胞百分比增加大于球体和二维培养组。纳米压痕结果显示，BGSC-organoids的内部和外部具有不同的硬度特性，形成了类似拱形的中空结构。机械模拟软件分析表明，BGSC壳-核结构有效地传递和分布外部压力 across 表面，维持内部细胞机械微环境的稳定性。
除了机械性能外，蛋白质的产生和分泌对于维持软骨表型至关重要。与球体和软骨细胞组相比，BGSC-organoid组表现出持续释放动力学特性(Cmax，Cl_F_obs)和软骨组织内更强的吸收(AUClast，AUCINF_obs)。双光子聚合光刻(TPL)显微镜结果显示，与细胞和球体治疗相比，BGSC-organoid治疗在OA相关病理过程中挽救了胶原纤维的损失。
6. BGSC-organoid培养系统通过机械诱导的Vimentin/14-3-3/FOXO3通路维持软骨生态位的生物学特征并 rejuvenate 衰老软骨细胞
RNA-Seq结合GO和KEGG富集分析显示，与ECM-受体相互作用和ECM蛋白聚糖相关的基因在BGSC-organoids中上调。免疫荧光染色和蛋白质印迹证实了波形蛋白(Vimentin)、14-3-3和FOXO3的蛋白水平升高。分子对接分析和异构体特异性IF染色进一步证实了特定14-3-3异构体(14-3-3β)在这一级联反应中的功能参与。这些结果表明，机械刺激可以调节波形蛋白的激活，诱导14-3-3β的上调，并通过FOXO3通路进一步促进软骨细胞的年轻化。
7. BGSC organoids在体内抑制胶原损失并恢复软骨功能
在小鼠中诱导内侧半月板失稳(DMM)手术后，每周通过膝关节注射给予二维培养物、球体或BGSC-organoids。器官组治疗的小鼠表现出由炎症引起的发热减少和疼痛耐受性增加。步态分析也显示，注射BGSC-organoids后DMM手术后小鼠的异常步态有所改善。X射线和三维重建CT结果显示，BGSC-organoid治疗后骨赘形成和软骨下骨硬化减少。随后的组织学检查显示，BGSC-organoid注射后OA相关的滑膜炎和软骨侵蚀减少。
在椎间盘退变(IVDD)模型中，BGSC-organoids的注射有效减轻了椎间盘的退变。与球体和细胞治疗组相比，BGSC-organoid治疗组表现出更大的椎间盘高度和强度。组织学分析显示，BGSC-organoids的给药显著逆转了穿刺引起的相对椎间盘高度指数(DHI)的降低。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种整合SOX9过表达BMSCs来源EVs的脱细胞生物墨水(dCSEV)，用于构建仿生梯度结构软骨类器官(BGSC-organoids)培养系统。该系统能够保持软骨生态位的特性，实现衰老软骨细胞的年轻化。通过单细胞测序技术，研究揭示了CPC-ProC分化轨迹在软骨细胞年轻化过程中的关键作用，并发现BGSC-organoids通过机械诱导的Vimentin/14-3-3/FOXO3通路增强机械抗性和持续释放软骨保护因子。动物实验证实BGSC-organoids在体内能够保持透明样软骨表型，延缓关节软骨和椎间盘的退变。
这项研究的创新之处在于将转录因子SOX9的软骨保护作用与外泌体对软骨细胞的高亲和力整合到三维控制的生态位结构中，显著提高了重编程效率。同时，构建的OAOC体外模型成功模拟了软骨的生理和生物力学微环境，为临床前OA治疗的生物安全性和有效性评估提供了理想的人源化软骨病理模型。具有增强扩增效率和再生能力的这些软骨类器官，为关节再生提供了一种有前景的新方法。
尽管该策略显示出明确的转化潜力，但在临床应用前仍存在几个关键障碍，包括符合GMP标准的复杂生物制品的规模化生产、综合质量控制框架的建立、在免疫缺陷动物中的进一步验证以及递送策略的优化等。未来的研究将通过多模型研究进一步验证其治疗效果，并结合其他组织工程方法，推动这一仿生系统的持续发展。
