《Frontiers in Immunology》：Farrerol inhibits ferroptosis and protects against LPS-induced acute lung injury by targeting the RUNX1/SLC7A11 axis
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本研究揭示了天然黄酮类化合物Farrerol通过直接结合并稳定转录因子RUNX1，进而转录激活SLC7A11表达，最终抑制脂质过氧化和铁死亡，为急性肺损伤（ALI）提供了新的潜在治疗策略。文章结合体内外模型，深入阐明了Farrerol-RUNX1-SLC7A11信号轴在ALI中的关键保护作用。
引言
急性肺损伤（ALI）是一种病因多样、死亡率高的危重病症，目前缺乏特异性治疗手段。Farrerol是一种从杜鹃花属植物中分离的天然黄酮类化合物，具有强大的抗炎和抗氧化活性。先前研究表明，Farrerol对脂多糖（LPS）诱导的ALI具有保护作用，但其潜在机制尚不明确。本研究旨在阐明Farrerol对抗LPS诱导的ALI的保护机制，重点关注其与铁死亡这一新型程序性细胞死亡方式的关系。铁死亡是一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，其典型特征包括谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性抑制、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）表达下调以及脂质过氧化终末产物的积累，在ALI的病理进展中起着重要作用。
材料与方法
本研究采用体外（LPS刺激的BEAS-2B人支气管上皮细胞）和体内（LPS诱导的小鼠ALI模型）模型评估Farrerol的疗效。通过蛋白质组学、细胞热位移分析（CETSA）、免疫共沉淀（Co-IP）和分子对接等技术探究其保护机制。细胞实验包括细胞活力（CCK-8）、细胞毒性（乳酸脱氢酶LDH释放）、细胞增殖（EdU）、细胞内活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、铁离子（Fe2+）检测（FerroOrange assay）、流式细胞术、免疫荧光、蛋白质印迹（Western blot）、铁死亡PCR阵列、Pull-down、双荧光素酶报告基因实验和实时定量PCR（RT-qPCR）等。动物实验使用C57BL/6小鼠建立ALI模型，评估肺组织病理损伤（H&E染色）、肺湿干重比（W/D ratio）、支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白浓度和细胞计数、 Evans Blue染色、TUNEL染色、免疫组化（IHC）以及铁死亡相关指标（谷胱甘肽GSH、丙二醛MDA、铁含量）检测。
结果
Farrerol抑制LPS诱导的BEAS-2B细胞损伤
研究首先在体外建立了LPS诱导的BEAS-2B细胞损伤模型。结果显示，LPS处理以剂量和时间依赖性方式降低细胞活力并增加LDH释放。选择10 μg/mL LPS处理12小时作为标准损伤模型。Farrerol预处理（10, 20, 40 μM，0, 2, 4小时）可剂量依赖性地改善细胞活力、减少LDH释放、维持正常细胞形态、促进细胞增殖并减少细胞死亡。其中，20 μM Farrerol预处理2小时显示出最显著的保护效果，表明Farrerol能有效对抗LPS诱导的支气管上皮细胞损伤。
Farrerol减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤
在LPS诱导的小鼠ALI模型中，Farrerol预处理（10, 20, 40 mg/kg）能剂量依赖性地减轻肺组织病理损伤。Evans Blue染色显示Farrerol显著减弱了LPS诱导的肺血管渗漏。TUNEL实验表明Farrerol能抑制肺组织细胞死亡。此外，Farrerol给药显著降低了LPS暴露小鼠的肺湿干重比、BALF中的蛋白浓度和总细胞数。这些结果证实Farrerol能在体内缓解LPS诱导的ALI。
Farrerol直接结合并上调RUNX1
为探寻Farrerol的直接分子靶点，研究人员进行了Pull-down实验结合质谱分析，鉴定出三个候选靶蛋白：RUNX1、EIF3E和SLC25A24。CETSA分析显示，Farrerol显著增强了RUNX1的热稳定性，而Co-IP实验证实了Farrerol与RUNX1的特异性相互作用。免疫荧光染色显示Farrerol与RUNX1在细胞核内共定位增强。分子对接预测Farrerol通过四个氢键（与Arg45, Asp48, Lys90, Arg130）结合在RUNX1的DNA结合结构域。此外，Farrerol以剂量依赖性方式上调RUNX1的蛋白表达，但不影响其mRNA水平。这些结果表明，Farrerol通过直接结合并稳定RUNX1蛋白发挥其保护作用。
RUNX1过表达显著抑制铁死亡
在确认Farrerol与RUNX1直接相互作用后，研究者在BEAS-2B细胞中过表达了RUNX1，以探究其功能角色。结果显示，RUNX1过表达特异性调控了铁死亡相关标志物，尤其是上调了GPX4并降低了4-HNE的水平。RUNX1过表达逆转了LPS诱导的Fe2+积累、ROS爆发、线粒体损伤和脂质过氧化。定量分析进一步证实，RUNX1能维持GSH水平、减少MDA产生、增强细胞活力并降低LDH释放，完全模拟了Farrerol的保护效应。这些发现突出了"Farrerol–RUNX1–铁死亡抑制"轴在肺部保护中的关键机制。
Farrerol在体外保护免受Erastin诱导的铁死亡
为了在独立于LPS的经典铁死亡模型中验证Farrerol的保护作用，研究使用了铁死亡诱导剂Erastin。Farrerol预处理能有效逆转Erastin引起的细胞活力下降、脂质过氧化增加、GSH耗竭、MDA积累、细胞内Fe2+超载以及线粒体超微结构损伤（包括线粒体皱缩和嵴破坏）。这表明Farrerol对由不同诱导剂触发的铁死亡具有广泛的保护效应。
RUNX1敲低逆转Farrerol诱导的铁死亡抑制
为了进一步验证RUNX1在Farrerol抑制铁死亡中的作用，研究者在BEAS-2B细胞中敲低了RUNX1表达。RUNX1敲低显著消除了Farrerol对LPS诱导的铁死亡特征的保护作用，包括线粒体嵴破坏和膜破裂、Fe2+积累增加、ROS产生增强、脂质过氧化水平升高以及GSH和MDA水平失衡。这些发现证明，Farrerol对LPS诱导的铁死亡的抑制作用是由RUNX1介导的。
RUNX1通过促进SLC7A11转录抑制铁死亡
为了确定RUNX1调控铁死亡的下游靶点，研究人员进行了铁死亡相关基因PCR阵列分析，发现RUNX1过表达显著改变了多个铁死亡相关基因的表达谱。在13个上调基因中，通过qPCR验证了四个最显著上调的基因（ELAVL1, SAT2, ALDH1A1, SLC7A11），并确定SLC7A11是对RUNX1过表达反应最突出的上调基因。双向验证进一步证实，RUNX1过表达上调，而RUNX1敲低则抑制了SLC7A11在mRNA和蛋白水平的表达。染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验证明，RUNX1直接结合并转录激活SLC7A11启动子，并通过点突变分析确认了其特异性结合位点。这些结果表明SLC7A11是介导RUNX1抗铁死亡功能的关键效应分子。
Farrerol在体内减轻LPS诱导的铁死亡
为了确定Farrerol在体内是否抑制铁死亡，研究系统评估了LPS诱导的ALI小鼠模型中的铁死亡相关参数。组织病理学分析显示，Farrerol预处理减轻了肺充血、水肿和肺泡破坏。此外，Farrerol逆转了LPS引起的SLC7A11下调和4-HNE上调。透射电子显微镜（TEM）分析进一步证实，Farrerol保持了线粒体完整性，与LPS组观察到的嵴破坏和膜损伤形成对比。生化检测表明，Farrerol预处理降低了肺组织中的铁和MDA水平，同时恢复了GSH含量。这些发现提示Farrerol通过抑制铁死亡发挥其对肺损伤的保护作用。
Farrerol的潜在毒性和安全性评估
在确认Farrerol对ALI的保护作用后，研究评估了其体内毒性谱。结果显示，以10、20和40 mg/kg的剂量给予Farrerol未引起主要器官（心、肝、脾、肾、肠）的病理损伤，也未导致关键血清生化参数（丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST、肌酐CREA、血尿素氮BUN、肌酸激酶CK、总胆固醇T-CHO）的显著改变。这表明Farrerol具有良好的治疗安全窗口，为其潜在的临床转化提供了关键的临床前证据。
讨论
本研究系统阐明了Farrerol通过靶向RUNX1-SLC7A11信号轴抑制铁死亡，从而减轻LPS诱导的ALI的机制。Farrerol作为一种天然化合物，此前已被报道在多种病理背景下缓解炎症和氧化损伤。本研究不仅证实了其在ALI中的保护作用，还首次揭示了其通过稳定RUNX1蛋白，进而转录激活SLC7A11来抑制铁死亡的新机制。RUNX1被鉴定为肺上皮细胞中铁死亡的新型转录调控因子，SLC7A11是其关键下游效应分子。与以往研究相比，本工作揭示了一条全新的Farrerol抑制铁死亡的通路。然而，研究也存在一些局限性，例如Farrerol与RUNX1结合位点的预测尚未通过实验（如点突变）严格验证；ALI涉及多种细胞类型损伤，本研究主要关注支气管上皮细胞；此外，结论仅在LPS模型中得到验证，未来需要在其他ALI模型（如盲肠结扎穿孔CLP模型）中进行进一步确认。
结论
本研究证明，Farrerol通过抑制铁死亡显著减轻LPS诱导的急性肺损伤。其作用机制是直接结合并稳定转录因子RUNX1，从而上调其下游靶基因SLC7A11的转录活性。这些发现首次提供了Farrerol通过调控RUNX1/SLC7A11信号通路抑制铁死亡的证据，为ALI的治疗提供了新的潜在靶点。
