靶向PDPN通过抑制β-连环蛋白介导的PD-L1表达增强黑色素瘤抗肿瘤T细胞活性

《Frontiers in Immunology》：Targeting PDPN enhances antitumor T-cell activity by disrupting β-catenin-mediated PD-L1 expression in melanoma

本研究揭示黑色素瘤中Podoplanin（PDPN）通过激活Wnt/β-catenin信号通路上调PD-L1表达、驱动免疫逃逸的新机制。靶向PDPN的抑制肽CY12-RP2可破坏PDPN–β-catenin–PD-L1轴，显著增强CD8+T细胞浸润及细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-1β）分泌，逆转免疫抑制微环境，为克服免疫检查点抑制剂耐药提供新策略。

　　

引言

黑色素瘤作为一种高度免疫原性且侵袭性强的恶性肿瘤，其肿瘤微环境（TME）中常有显著的淋巴细胞浸润，并对免疫治疗干预表现出较高的响应性。致癌糖蛋白Podoplanin（PDPN）在多种癌症类型中常过度表达，通过与血小板及其他基质细胞上的CLEC-2相互作用，促进转移扩散并参与基质免疫抑制。尽管PDPN的促瘤作用已有较多报道，但其在黑色素瘤免疫逃逸中的具体分子机制尚不完全清楚，有待进一步阐明。肿瘤细胞主要通过上调PD-L1来逃逸T细胞介导的免疫监视。β-catenin信号通路是促进肿瘤免疫逃逸的关键机制之一，其通过调控PD-L1表达，抑制CD8⁺T细胞的肿瘤内聚集，导致免疫耐受。本研究旨在阐明PDPN在黑色素瘤免疫调节中的作用，特别是其通过β-catenin介导PD-L1表达的机制，并评估靶向PDPN的抑制肽CY12-RP2的治疗潜力。

材料与方法

研究使用A375、B16-F10和HEK293T细胞系，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。通过慢病毒转导实现PDPN的敲低和CTNNB1（β-catenin）的过表达。采用蛋白质印迹法（Western blot）分析PD-L1、β-catenin及其磷酸化形式（S552）的表达；流式细胞术和免疫荧光法检测细胞膜PD-L1的水平；酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中炎症细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-1β）的浓度。利用人黑色素瘤组织微阵列（HMelC112CD01）进行多重免疫荧光染色，评估PDPN、PD-L1和CD8⁺T细胞的空间分布关系。通过荧光素酶报告基因实验验证β-catenin对CD274（PD-L1编码基因）启动子的转录激活作用。RNA测序（RNA-seq）分析CY12-RP2处理后的B16-F10细胞的转录组变化，并进行KEGG和GO富集分析。在动物实验中，将B16-F10细胞皮下接种至BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠体内，评估CY12-RP2（50 mg/kg）的体内抗肿瘤效果，并通过抗CD8α抗体耗竭CD8⁺T细胞以验证其依赖性。TUNEL实验检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况。

结果

PDPN与黑色素瘤免疫抑制景观相关

生物信息学分析显示，PDPN表达与多个免疫检查点分子（如PD-L1、CTLA4、LAG3、TIGIT、BTLA）呈显著正相关，其中与PD-L1的相关性最强（r = 0.504, p < 0.001）。单细胞RNA-seq分析表明，PDPN高表达与抗肿瘤免疫细胞（如CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、M1巨噬细胞）的浸润呈负相关，而与免疫抑制性细胞（如M2巨噬细胞、调节性T细胞）呈正相关。在免疫缺陷（BALB/c裸鼠）和免疫健全（C57BL/6）小鼠模型中，CY12-RP2处理均能显著抑制肿瘤生长，在免疫健全小鼠中的抑瘤率（60.62%）高于免疫缺陷小鼠（42.22%），提示其抗肿瘤效应依赖于适应性免疫系统。

PDPN通过PD-L1共表达及减少CD8⁺T细胞促进免疫抑制微环境

对人黑色素瘤组织微阵列的分析发现，PDPN与PD-L1在原发性（共表达率46.5%）和转移性（共表达率43.8%）黑色素瘤标本中存在显著共表达。空间转录组分析显示，PDPN高表达区域CD8⁺T细胞浸润密度显著降低（减少约4.2倍），表明PDPN促进了T细胞的排斥。这种负相关性在原发性（r = -0.2884, p < 0.05）和转移性（r = -0.444, p < 0.01）黑色素瘤中均得到验证。

PDPN调控黑色素瘤细胞表面PD-L1表达

RNA-seq分析表明，CY12-RP2处理可引起B16-F10细胞中1228个基因的差异表达，其中免疫相关通路（如T细胞受体、NF-κB、Toll样受体信号通路）显著富集。GO分析显示，T细胞增殖、炎症反应等生物学过程被激活。在细胞水平上，PDPN敲低或CY12-RP2处理均能显著降低A375和B16-F10细胞中总PD-L1蛋白及细胞膜PD-L1的水平，证实PDPN对PD-L1表达的调控作用。

PDPN通过β-catenin依赖性机制促进PD-L1 mRNA转录

生物信息学及实验验证表明，PDPN与β-catenin表达呈正相关。PDPN敲低或CY12-RP2处理可降低β-catenin的总蛋白水平及其S552位点的磷酸化水平。荧光素酶报告基因实验证实，β-catenin过表达可激活CD274启动子。更重要的是，在PDPN敲低或CY12-RP2处理的细胞中过表达CTNNB1（β-catenin编码基因），能够恢复PD-L1的表达水平，证明β-catenin是PDPN调控PD-L1的关键下游介质。

CY12-RP2抑制B16-F10肿瘤生长的作用依赖于CD8⁺T细胞

在C57BL/6小鼠模型中，CY12-RP2治疗显著增加了肿瘤内CD3⁺T细胞和Granzyme B⁺CD8⁺细胞毒性T细胞的浸润，并提高了脾脏和淋巴结中细胞毒性CD8⁺T细胞的比例。血清中促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-1β）水平也显著升高。然而，当使用抗CD8α抗体耗竭CD8⁺T细胞后，CY12-RP2的抗肿瘤效应被显著削弱（抑瘤率分别从63.2%降至36.8%，从80.5%降至59.7%）。TUNEL实验进一步证实，CY12-RP2诱导的肿瘤细胞凋亡在CD8⁺T细胞耗竭后明显减少。同时，肿瘤组织内PD-L1的表达在CY12-RP2治疗后显著降低。

讨论

本研究系统阐明了PDPN在黑色素瘤免疫逃逸中的核心作用。研究发现PDPN通过激活Wnt/β-catenin信号通路，转录上调PD-L1的表达，从而抑制CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能。靶向PDPN的抑制肽CY12-RP2能够有效阻断这一轴心信号，降低PD-L1水平，促进CD8⁺T细胞的浸润和活化，并激发促炎细胞因子的释放，最终逆转肿瘤的免疫抑制微环境。尽管细胞因子如IFN-γ和TNF-α本身可能通过JAK–STAT1或NF-κB/ERK1/2通路上调PD-L1，但本研究中CY12-RP2的净效应是显著抑制PD-L1，凸显了其主导作用。该研究不仅揭示了PDPN–β-catenin–PD-L1这一新的免疫抑制轴，也为克服黑色素瘤对免疫检查点阻断（ICB）的耐药性提供了潜在的联合治疗策略。然而，PDPN介导的免疫调节可能还涉及其他机制，如通过PDPN⁺癌症相关成纤维细胞（CAFs）或与CLEC-2的相互作用影响其他免疫细胞，这有待未来研究进一步探索。总之，靶向PDPN为增强黑色素瘤免疫治疗效果开辟了新的途径。