《Frontiers in Microbiology》：Root exudate monosaccharides modulate the pathogenicity of Ralstonia pseudosolanacearum
根系分泌物单糖调控青枯假单胞菌致病性
青枯菌物种复合群（RSSC）是一种毁灭性的土传病原体，可引起茄科作物青枯病。然而，RSSC对根系分泌物释放到根际的关键组分——单糖的响应尚不清楚。通过模拟根际信号，在培养基中补充烟草根系分泌物来源的几种典型单糖，可检测其对细菌毒力因子表达的影响。转录组分析表明，半乳糖显著改变了RSSC的生理状态，诱导出类似于植物侵染期间的状态。在测试的单糖中，半乳糖特异性上调了III型分泌效应因子的表达。值得注意的是，半乳糖还积极诱导氮代谢，导致一氧化二氮和其他活性氮物种的产生，这些物质可能与活性氧物种一样增强致病性。此外，从半乳糖诱导的RSSC培养物中提取的代谢物浸润到烟草叶片中可引发细胞死亡。
引言
由植物病原青枯菌物种复合群（RSSC）引起的青枯病是影响全球许多重要作物生产的最重要病害之一，特别是经济作物烟草、番茄、马铃薯和香蕉。RSSC通常通过伤口或次生根产生的自然开口从表面或土壤侵入植物根部，定殖于木质部导管，进而阻塞植物水流，导致萎蔫症状。侵染后，RSSC细胞附着在宿主植物细胞外部，并将大量III型效应因子（T3Es）注入植物细胞。RSSC可以在土壤中长期存在，直到被宿主来源的信号激活。趋化性——能动细菌对化学试剂的定向运动——是一种常见现象。细菌可以检测并响应多种化学刺激，包括氨基酸、碳水化合物、有机酸、芳香族化学物质和磷酸盐。对于植物病原体而言，通过根系分泌物识别宿主植物是成功入侵的第一步。细菌趋化性也是共生、感染和根部定殖等生态相互作用的关键前驱。
根系分泌物包括释放到根际的有机和无机物质的复杂混合物。植物将高达40%的光合产物分配给根际，包括低分子量化合物如氨基酸、有机酸、糖和其他次生代谢物，以及高分子量化合物如多糖和蛋白质。例如，宿主植物的L-谷氨酸已被证明是促进青枯菌在根和茎中定殖并加速番茄植株发病的关键活性成分。从植物细胞壁释放的半乳糖醛酸可用于滋养细菌病原体细胞并加速青枯病的病程。青枯菌利用色氨酸和甲硫氨酸来增强毒力。此外，根系分泌物中的有机酸如肉桂酸、肉豆蔻酸和富马酸可诱导生物膜形成并调节细菌运动。果糖、甘露糖和阿拉伯糖在基本1/4 M63培养基中诱导菌株OE1-1的生物膜形成。根系分泌物还可以激活syrB基因，由丁香假单胞菌丁香致病变种合成植物毒素丁香霉素。根系分泌物被甲基接受趋化蛋白（MCPs）感知，这些是细菌细胞表面的跨膜化学受体。配体结合后，MCPs通过趋化性（Che）蛋白启动信号级联反应来调节鞭毛运动。基因组分析表明RSSC菌株编码超过20个MCPs。例如，菌株Ps29表达22个MCPs，其中两个作为趋氧传感器功能，而另外三个——McpA、McpM和McpT——分别介导对氨基酸、L-苹果酸和D-苹果酸的趋化性。McpM介导的趋化性已被证明对番茄中的完全毒力至关重要。此外，RS_RS07350同源物（命名为McpC）和McpP已被鉴定为青枯假单胞菌Ps29中的柠檬酸化学受体，后者还介导对磷酸盐的正趋化性和对马来酸盐的负趋化性。
基因表达分析在确定青枯菌的各种毒力因子方面发挥了关键作用。单糖（D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖和D-半乳糖）已被证明可激活菌株OE1-1中ralfuranones的产生。为了研究根部释放的单糖对青枯假单胞菌WXQ_10主要致病因子表达模式的影响，选择了六种单糖培养细胞并进行青枯菌的转录组分析。比较转录组分析显示，在半乳糖中培养的WXQ_10菌株的差异表达基因大多富集在毒力因子中，例如III型分泌系统、III型效应因子。进一步研究了氮代谢的作用，例如反硝化作用，表明活性氮物种可能与活性氧物种一样是导致病原发生的关键因素。这项研究强调了在半乳糖培养的毒力过程中氧化还原平衡的重要性。除了细胞间相互作用外，RSSC在不同单糖添加下产生的代谢物通过注入植物叶片也表现出不同的病理学特征。
材料与方法
青枯假单胞菌菌株在营养琼脂培养基中培养。3天后，取青枯假单胞菌的乳白色菌落，溶解并接种于MB培养基中。修改的B培养基用于WXQ_10的培养和草图基因组测序。MGRL培养基包含特定成分，MGRLS培养基通过补充3%蔗糖制备。
对于RNA提取，细胞首先在液体MB培养基中培养至OD600nm为2.0，然后离心，弃去上清液。将沉淀溶解在MGRL培养基中并接种到添加单糖的MGRLS培养基中，最终OD600nm约为1.0。细胞溶液分别在含有0.5%甘露糖、0.5% L-阿拉伯糖、0.5%木糖、0.5%果糖、0.5%葡萄糖和0.5%半乳糖（终浓度）的MGRLS培养基中于三角瓶中培养，然后在旋转摇床中以180 rpm速度、28°C温度培养4小时，以备RNA测序。弃去上清液，将沉淀在液氮中冷冻并储存在-80°C用于RNA提取。
对番茄和辣椒植物的致病性通过根部感染进行测定。将细菌悬浮液（109CFU·ml-1）每盆施用10 ml。首先使用1 ml移液器吸头在土壤中制作四个等距孔，并将悬浮液均匀倒入这些孔中。将接种的植物置于30°C生长室中以观察特征性病害症状的发展。
菌株WXQ_10的基因组使用Illumina NovaSeq平台进行测序。使用TruSeqTM DNA样本制备试剂盒构建片段长度为150 bp的文库。高质量读段用于使用A5-MiSeq和SPAdes进行从头基因组组装，分别构建重叠群和支架。tRNA、rRNA和非编码RNA通过软件tRNAscan-SE v1.3.1、Barrnap v0.9 rRNA预测，并通过与Rfam数据库比较获得。草图全基因组序列存入NCBI。
原始测序数据经过质量过滤获得清洁数据。清洁读段与Rfam数据库比较以测量核糖体RNA的污染。使用软件RSEM量化基因或RNA的表达。数据在Majorbio云平台在线分析。如果基因表达水平差异大于2倍且调整后p值小于0.05，则认为该基因在两种条件下差异表达。基于序列信息，在上述平台上进行基因功能注释、差异表达分析、GO和KEGG通路富集分析。转录组原始数据存入NCBI。
使用TransZol Up RNA试剂盒从WXQ_10菌株中提取RNA。对于qPCR分析，在将细菌（初始OD600= 1.0）接种到含单糖的MGRLS培养基后1、4和12小时收集样本。在4小时时间点收集的样本额外用于转录组分析，将1.8 ml样本在4°C以5000 rpm离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀在液氮中冷冻并储存在-80°C用于RNA提取。每个样本三个重复用于RNA提取。通过微量分光光度法测定RNA浓度和纯度。
使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR进行cDNA合成。对于cDNA合成，将4 μl提取的RNA与10 μl无RNase水混合，并在65°C水浴中孵育5分钟。然后加入1 μl基因组DNA去除剂和4 μl 5X TransScript All-in-one SuperMix for qPCR。将混合物在42°C孵育15分钟，然后在85°C孵育5秒以灭活酶。
使用定量PCR（qPCR）反应进行绝对定量，重复25 μl反应，使用PerfectStart? Green qPCR SuperMix，包括1×预混液、每个扩增片段400 nM正向和反向引物以及50 ng模板cDNA。反应在ABI PRISM 7300实时PCR系统上进行，反应参数为10分钟聚合酶激活，随后进行40个循环，每个循环包括95°C 15秒和57°C 1分钟。使用从OD600值为1.0的WXQ_10细胞收集并在含单糖的MGRLS培养基上反转录的RNA进行10倍稀释（2.5至0.0025 μg cDNA）制作标准曲线。qPCR结果以三个不同时间点的平均值±标准差表示。
通过在28°C和180 rpm下在MGRLS培养基（300 ml三角瓶）中培养青枯菌菌株4天来提取代谢物。细菌代谢物用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并的萃取物通过旋转蒸发干燥。将残留物溶解在500 μl甲醇中用于烟草接种，或溶解在50 μl甲醇加450 μl 0.9% NaCl中用于离体番茄叶片。烟草、番茄和辣椒植物在受控条件下生长。三至四周龄的植物通过在使用无菌注射器制造两个微伤口后向第三叶腋注射50 μl代谢物进行接种；或者，将离体番茄叶片在培养皿中培养72小时，叶柄浸入测试溶液中以检查提取物的植物毒力。所有接种材料在培养箱中维持3天。
结果
验证WXQ_10对番茄和其他茄科作物的致病性，通过根部感染浇水番茄和辣椒幼苗。植株随后从顶部叶片开始出现萎蔫症状，证实了WXQ_10的毒力。为了确定其分类学地位，对WXQ_10进行了全基因组测序，生成总共1,098 Mbp的双末端读段。组装和注释指标见附表S1。完整基因组长度为5,638,120 bp，GC含量为67.05%，编码4,973个预测的编码序列。此外，还鉴定了51个tRNA、三个rRNA（5S、16S和23S）和82个非编码RNA。
青枯菌物种复合群（RSSC）以前由四种系统型组成，仅使用16S rRNA序列无法可靠解析分类学地位。为了了解与充分研究的RSSC菌株的遗传关系，进行了全基因组平均核苷酸一致性（ANI）分析。基于ANI值的系统发育重建显示WXQ_10属于青枯假单胞菌。根据既定标准，ANI值高于95-96%的菌株被视为同种。在分析的八个菌株中，七个——包括GMI1000、Rs-T02、YC45、FQY_4、SD54、Y45和WXQ_10——形成了一个一致性簇， pairwise ANI值超过98.9%，支持它们分类为一个物种。值得注意的是，WXQ_10与青枯假单胞菌模式基因组的ANI相似性为96.77%，基因组覆盖度为83.4%。这一结果进一步证实了被广泛研究的菌株GMI1000也应属于青枯假单胞菌。
在六种单糖处理和蔗糖对照中，每个样本的平均原始测序数据包含约3300万读段，代表约5,122 Mbp的原始碱基。经过接头去除和质量过滤后，每个样本平均保留3200万清洁读段和4,005 Mbp清洁碱基。清洁数据的平均错误率为0.013%，Q20和Q30值平均分别为98.2%和94.48%。通过Rfam比对确定的所有七个样本的平均rRNA含量为11.19%，所有样本均低于15%的阈值。
Venn图显示了每个样本中表达水平≥1 TPM的mRNA和sRNA转录本数量。平均每个样本检测到629个sRNA、4,822个mRNA以及总共5,451个转录本。mRNA和sRNA的差异表达基因数量也进行了总结。在WXQ_10基因组注释的4,973个蛋白质编码基因中，约97.0%在测试的实验条件下表达。
与蔗糖相比，半乳糖引发了487个上调和546个下调的DEGs；L-阿拉伯糖诱导了334个上调和176个下调的DEGs；甘露糖导致103个上调和157个下调的DEGs；木糖导致268个上调和217个下调的DEGs。总共在所有比较中鉴定到1,689个DEGs。值得注意的是，果糖和葡萄糖处理各自诱导了少于100个上调和下调类别的DEGs。相比之下，半乳糖引发了最显著的转录变化，每个方向超过500个DEGs。关于sRNA特异性DEGs，半乳糖中上调的DEGs数量（162个）最高，半乳糖再次表现出最强效应，显示162个上调的sRNA——是第二高处理（L-阿拉伯糖，70个上调sRNA）的两倍多，总共检测到318个sRNA DEGs。半乳糖中下调的sRNA DEGs数量为45个，在所有处理中排名第三。在所有4,973个编码序列中，在六个样本与蔗糖样本比较中鉴定到1,326个DEGs。
与半乳糖处理中sRNA的高表达模式不同，发现mRNA的下调DEGs数量显著高于其他处理，大约是第二高（木糖样本中153个）下调样本的三倍。与蔗糖相比，上调DEGs数量在半乳糖、L-阿拉伯糖和木糖处理中分别为298、283和242个。样本火山图与蔗糖样本的比较见附图S2。基于相关性分析和PCA分析，发现半乳糖处理的表达模式与其他五种处理不同，与蔗糖对照相比，相关性小于0.94。PCA分析也显示半乳糖处理与其他处理差异很大。基于热图，与蔗糖处理相比，半乳糖处理与其他处理存在明显差异。
与蔗糖处理相比，果糖、葡萄糖和甘露糖样本中显著富集的KEGG通路少于0.25。具体而言，果糖处理仅导致三个通路显著富集：细菌趋化性、鞭毛组装和苯丙氨酸代谢。葡萄糖和甘露糖处理分别导致四个通路（细菌趋化性、鞭毛组装、氮代谢和双组分系统）和三个通路（细菌趋化性、氮代谢和双组分系统）富集。其中，细菌趋化性是所有三种处理中调节最显著的通路，但其低富集因子（<0.25）表明相应的底物可能仅被一个甲基接受趋化蛋白（MCP）感知。相比之下，半乳糖处理引发了明显更强的响应，排名第一的氮代谢通路的富集因子达到0.6。五个通路显著富集，包括氮代谢、ABC转运蛋白、细菌趋化性、核糖体和聚酮化合物糖单元生物合成。类似地，木糖处理也富集了五个通路——ABC转运蛋白、氮代谢、光合作用、细菌趋化性和鞭毛组装——其中氮代谢和ABC转运蛋白最为显著。此外，几种细菌分泌系统（I型、II型和VI型）在木糖中富集，但不显著。值得注意的是，L-阿拉伯糖诱导了最广泛的转录重编程，所有可视化的通路均显著富集，特别是氮代谢、ABC转运蛋白和鞭毛组装。在半乳糖、木糖和阿拉伯糖处理中，近四十个基因在某些通路中富集，表明这三种单糖在添加到培养基中后显著改变了WXQ_10的代谢谱。
植物细胞壁是异质结构，纤维素微纤维嵌入果胶、半纤维素和木质素的基质中。为了克服植物细胞壁的屏障，植物病原细菌可以产生能够降解细胞壁聚合物的酶[细胞壁降解酶（CWDEs）]。在WXQ_10中，通过cazy数据库鉴定和注释了33个糖基转移酶（GT）、3个多糖裂解酶（PL）、30个碳水化合物酯酶（CE）、17个辅助活性（AA）、11个碳水化合物结合模块（CBM）和44个糖苷水解酶（GH）。在总共138个编码碳水化合物活性酶的基因中，有44个在至少一个样本中受到显著调控。在木糖处理中，五个DEGs中有四个上调（GH28、CE1、CBM32、GH109），一个下调（GT104）。在果糖处理中，仅有两个DEGs上调（GH28、CE10）。葡萄糖中属于CE10基因的两个DEGs中一个上调，另一个下调。在阿拉伯糖中，鉴定到13个DEGs，11个DEGs上调，仅2个下调。在甘露糖中，八个DEGs中有七个上调，仅一个DEG下调。
与上述上调DEGs的样本不同，半乳糖样本中总共27个DEGs中有18个是下调的DEGs，九个DEGs上调并属于AA1、PL3、PL6、GH23、GH109、CE3、CE4、GT20家族。最重要的是，与果胶消化和木质素消化相关的DEGs在半乳糖样本中表达最高（PL6基因1736，log2FC 3.07；AA1_3基因3,914，log2FC 2.42）。
一氧化氮（NO）和活性氮物种已成为所有生物体中关键的信号和调节分子。氮代谢是半乳糖、木糖和L-阿拉伯糖中最显著富集的通路。进一步分析显示，半乳糖中氮循环基因的表达模式与阿拉伯糖中的不同。半乳糖中从亚硝酸盐到N2途径的DEGs显著上调。然而，阿拉伯糖中的该途径显著下调。
在厌氧或缺氧条件下，细菌可以使用硝酸盐（NO3-）作为电子传递链的最终电子受体来完成物质和能量交换。出乎意料的是，在好氧条件下，与反硝化和厌氧氨氧化相关的基因也活跃表达，尤其是在半乳糖处理中。从亚硝酸盐到氨的异化硝酸盐还原显著下调。
发现与氧化还原信号相关的regA和regB在半乳糖处理中也上调，它们存在于氧化磷酸化的调节途径中。例如，细胞色素c氧化酶cbb3型基因277–280和细胞色素bd复合物基因2,703–2,702。这可能是细胞内和细胞外环境中活性氧物种和活性氮物种产生的后果。
III型效应蛋白是引起植物萎蔫的关键因素。基于非冗余蛋白质数据库的研究，发现WXQ_10基因组中编码了54个III型效应蛋白。然而，与蔗糖相比，仅29个效应因子在这些单糖处理中差异表达。在这些DEGs中，仅半乳糖培养基中的一个基因显著下调。最明显的现象是，总共29个DEGs中有19个仅在半乳糖中显著上调，表明半乳糖可以显著改变液体培养基中细胞的代谢途径，使其趋向于受侵染植物的状态。
细胞外多糖（EPS）是RSSC中一种不寻常的胞外多糖毒力因子。eps操纵子由epsAPBCDE组成，其启动子单独负责其调节转录。EPS I是一种>1,000 kDa的酸性聚合物，由2-N-乙酰半乳糖胺、2-N-乙酰半乳糖胺醛酸和2-N-乙酰-2,4,6-三脱氧半乳糖的三聚重复单元组成，N4位被3-羟基丁酸修饰。理论上，添加半乳糖应促进EPS的产生。出乎意料的是，大多数EPS基因的表达并未上调。相反，一些基因下调。EPS不是植物组织内根部入侵或生长所必需的，但却是萎蔫和致死所必需的，因为它阻塞了木质部中的水流。EPS基因下调的原因可能是WXQ_10细胞正处于侵入植物细胞和消化植物细胞壁的中间阶段。
一组植物细胞壁降解酶在疾病过程中也扮演重要角色，特别是半纤维素相关基因显著上调。植物细胞壁降解多聚半乳糖醛酸酶（PGs）是该病原体的重要毒力因子。PehA（内切-PG）或PehB（外切-PG）或两者均被证明对受伤茄子的致病性通过缺失突变体得到证实。基因823（果胶酸裂解酶，PL3家族）在半乳糖中显著上调，有助于消化植物细胞壁。除了消化植物细胞外，一些酶可以被诱导来消化自身或其他细菌的细胞壁。例如，基因927（肽聚糖裂解酶，GH23）仅在半乳糖中表达。
为了评估单糖在RSSC中诱导的次生代谢物的毒力，从在不同糖补充的培养基中生长的培养物中提取了代谢物。这些提取物被浸润到烟草叶片中或用于浸泡离体番茄叶柄。来自半乳糖培养物的提取物表现出最强的毒力，导致烟草叶片严重的组织损伤和细胞死亡。此外，使用离体番茄叶片的体外试验证实，半乳糖来源的提取物导致广泛的软化和腐烂。除了半乳糖，来自葡萄糖和麦芽糖培养物的提取物也显示出可测量的植物毒性，而来自阿拉伯糖和甘露糖的提取物未诱导显著症状。这些关于单糖差异效应的发现与先前报道的一致。
讨论
植物根部分泌的化感物质在土壤健康和土传病害中起着关键作用。本研究旨在研究烟草根部释放的单糖对RSSC毒力因子产生的作用。这将增强我们对植物根系分泌物在植物-微生物相互作用中生态效应的理解，并有助于揭示烟草青枯病与根系分泌物积累的化感物质之间的关系，为病害控制提供新见解。
几种毒力因子有助于青枯病的发展。这些毒力因子包括产生细胞外多糖（EPS）、一组植物细胞壁降解酶、蹿动和游动运动、趋化性以及通过III型分泌系统（T3SS）分泌的几十种效应因子。青枯菌的毒力因子通过一个涉及群体感应和未定义的植物信号的复杂连锁级联进行调节。两个主要毒力因子，EPS和T3SS，通过全局调节因子PhcA经由群体感应分子3-羟基棕榈酸甲酯（3-OH-PAME）控制。然而，在培养条件下（OD600= 1.0），细胞浓度不足以激活群体感应系统。此外，基因3462编码的酰基高丝氨酸内酯合成酶和基因3463编码的LuxR家族转录调节因子、群体感应系统调节因子也未显著上调。导致半乳糖添加引起效应因子更高分泌的机制尚未发现。
特定甲基接受趋化蛋白（MCPs）的表达在mRNA水平上响应几种单糖而改变，表明其在趋化感应而非碳利用中的作用。果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和麦芽糖上调了MCP1076，证实了它们作为趋化剂的作用，并且没有一种作为化学驱避剂。
EPS是植物病原体RSSC的一种不寻常的胞外多糖毒力因子。启动子单独负责由epsAPBCDE组成的eps操纵子的调节转录。EPS I是一种>1,000 kDa的酸性聚合物，由2-N-乙酰半乳糖胺、2-N-乙酰半乳糖胺醛酸和2-N-乙酰-2,4,6-三脱氧半乳糖的三聚重复单元组成，N4位被3-羟基丁酸修饰。理论上，添加半乳糖应促进EPS的产生。出乎意料的是，大多数EPS基因的表达并未上调。相反，一些基因下调。EPS不是植物组织内根部入侵或生长所必需的，但却是萎蔫和致死所必需的，因为它阻塞了木质部中的水流。EPS基因下调的原因可能是WXQ_10细胞正处于侵入植物细胞和消化植物细胞壁的中间阶段。
一组植物细胞壁降解酶在疾病过程中也扮演重要角色，特别是半纤维素相关基因显著上调。植物细胞壁降解多聚半乳糖醛酸酶（PGs）是该病原体的重要毒力因子。PehA（内切-PG）或PehB（外切-PG）或两者均被证明对受伤茄子的致病性通过缺失突变体得到证实。基因823（果胶酸裂解酶，PL3家族）在半乳糖中显著上调，有助于消化植物细胞壁。除了消化植物细胞外，一些酶可以被诱导来消化自身或其他细菌的细胞壁。例如，基因927（肽聚糖裂解酶，GH23）仅在半乳糖中表达。
一氧化氮（NO）和其他活性氮物种（RNS）是植物中极其重要的信号分子，参与一系列生理反应。在植物中，RNS似乎诱导涉及抗氧化反应的基因以及对病原体抗性相关的基因。此外，RNS可能作为对病原体攻击的超敏反应的一部分，促进程序性细胞死亡。然而，至今在高等植物中未发现NOS基因或蛋白质。与茄科植物中的RSSC类似，植物中的内生菌可能是RNS的来源。这就是为什么在半乳糖诱导下许多效应因子分泌时氮代谢活跃的原因。
III型分泌系统（T3SS）的协调上调与运动性（例如，甲基接受趋化蛋白，MCPs）和胞外多糖（EPS）生物合成的下调相协调，代表了植物病原体（如丁香假单胞菌、青枯菌和黄单胞菌属）成功侵染所必需的关键生活方式转变。这种转录重编程优化了宿主入侵期间的资源分配。具体而言，一旦病原体到达感染部位，抑制能量密集型过程如趋化性和鞭毛运动可以节约ATP。EPS基因（一个代谢成本高昂的途径）的同时下调将碳和能量重新分配给T3SS的组装和功能。此外，减少EPS产生可能促进一种更具攻击性的、类似浮游状态，促进与宿主细胞的直接接触，从而确保通过T3
