《Frontiers in Immunology》：Elevated circulating cell-free mitochondrial DNA in fabry disease: insights into inflammatory activation
1 引言
法布里病（Fabry disease, FD）是一种罕见的X连锁溶酶体贮积症，由编码α-半乳糖苷酶A（α-GalA）的GLA基因突变引起。突变导致α-GalA活性降低或缺失，造成球形三脂酰基鞘脂醇（Gb3）及其脱酰基形式（lyso-Gb3）在多种组织中累积，最终引发细胞功能障碍和多器官损伤。FD临床分为经典和非经典表型。经典FD特征为残余α-GalA活性极低或无，多系统广泛受累；非经典FD则保留部分α-GalA活性，器官损伤通常局限于特定系统，如心脏或肾脏。酶替代疗法（enzyme replacement therapy, ERT）是FD的主要治疗手段。
循环游离DNA（circulating cell-free DNA, ccf-DNA）近年来被确认为损伤相关的分子模式，包括线粒体来源的ccf-DNA（ccf-mtDNA，线粒体功能障碍的标志物）和核来源的ccf-DNA（ccf-nDNA）。ccf-DNA水平升高已在多种疾病状态中被报道，凸显其作为疾病活动性和治疗反应生物标志物的潜力。ccf-mtDNA的释放可通过多种机制发生，包括对受损线粒体的吞噬清除。一旦进入细胞外空间，它可通过多种途径促进炎症反应，例如激活环状GMP-AMP合酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路。
线粒体功能障碍和炎症信号传导均是FD发病机制的核心。本研究旨在评估ccf-DNA作为FD诊断生物标志物的价值，并探讨其在炎症激活中的潜在作用。
2 材料与方法
2.1 研究人群、临床数据收集与评估
研究招募了2019年9月至2025年3月期间在北京大学第一医院神经内科定期随访的FD患者。诊断基于临床病史和实验室检查结果（GLA基因突变、α-GalA活性和Lyso-Gb3水平），并依据中国FD共识。排除了患有与FD无关的严重合并症、过量饮酒、非法药物使用或重度吸烟的患者。同时招募了年龄和性别匹配的健康对照（healthy controls, ctrls）。
收集了所有患者的全面人口统计学和临床数据。使用标准化临床检查和验证量表评估多系统受累情况，包括心脏、肾脏、脑部和周围神经系统表现。总体疾病严重程度使用Mainz严重程度评分指数（Mainz Severity Score Index, MSSI）评估，心脏受累使用左心室质量指数（left ventricular mass index, LVMI）评估，肾功能使用估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）、尿白蛋白/肌酐比值（albumin-to-creatinine ratio, ACR）、尿蛋白/肌酐比值（protein-to-creatinine ratio, PCR）和24小时尿蛋白（24-hour proteinuria, 24h-P）评估。脑部受累通过T2-FLAIR磁共振成像上的Fazekas量表对白质病变（white matter lesions, WML）进行分级，周围神经疼痛使用视觉模拟量表（Visual Analogue Scale, VAS）评估过去24小时内的峰值疼痛强度。
2.2 研究设计
为研究ccf-DNA在FD中的表达状态，比较了初治FD患者与健康对照的ccf-mtDNA拷贝数、ccf-nDNA拷贝数和mtDNA/nDNA比值。为评估ERT的影响，比较了短期ERT（≤ 12个月）组与健康对照、长期ERT（> 12个月）组与健康对照，以及短期与长期ERT组之间的这些参数。为研究与炎症的关联，分析了ccf-mtDNA、ccf-nDNA、mtDNA/nDNA比值与14种炎症细胞因子之间的相关性。
为评估ccf-DNA的临床价值，评估了ccf-DNA指标与疾病表型、基因型和临床标志物的关系。在调整性别和年龄后，检查了其与疾病持续时间、α-GalA活性、Lyso-Gb3以及临床标志物（包括MSSI、LVMI、eGFR、ACR、PCR、24h-P、Fazekas评分和VAS评分）的相关性。GLA突变被分类为截短型或非截短型。根据性别、疾病亚型（经典 vs. 非经典）、GLA基因型（截短型 vs. 非截短型）以及临床特征（如MSSI高低、有无肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy, HCM）、有无慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）、WML轻重、有无神经痛、疼痛轻重）进行了亚组分析。
2.3 实验室检测
2.3.1 ccf-mtDNA和ccf-nDNA的定量
对FD患者和健康对照的血浆ccf-mtDNA和ccf-nDNA绝对拷贝数进行定量。血浆样本在采血后立即处理，经过反复离心以防止细胞裂解并消除潜在的细胞污染物。使用磁珠法血浆游离DNA提取试剂盒从200 μL血浆中提取ccf-DNA。
采用定量逆转录PCR（quantitative reverse-transcription PCR, RT-qPCR）方法，针对线粒体NADH脱氢酶1（MT-ND1）基因定量ccf-mtDNA，针对核β-肌动蛋白（ACTB）基因定量ccf-nDNA。反应体系为20 μL，包含2 μL ccf-DNA、1× UltraSYBR Mixture、0.2 μM的MT-ND1或ACTB引物以及无核酸酶水。扩增条件为：95°C 10分钟；95°C 15秒、60°C 1分钟，共40个循环；最后95°C 30秒、65°C 30秒、95°C 30秒。使用Agilent Aria version 1.71分析数据。ACTB作为内参基因。根据包含MT-ND1和ACTB的克隆载体连续稀释生成的标准曲线计算绝对拷贝数。
2.3.2 炎症细胞因子检测
从初治FD患者采集外周血于EDTA管中，立即在4°C下以1,240 ×g离心5分钟。分离血浆并于-80°C冷冻保存。使用夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒检测14种炎症细胞因子（IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-17F, IL-22, TNF-α, TNF-β）。使用流式细胞仪检测各样本中细胞因子浓度，并使用CYTOSYS 2.0软件进行分析。
2.3.3 GLA基因遗传分析
对临床怀疑FD的先证者，使用干血斑样本进行GLA基因靶向二代测序，同时测定α-Gal A活性和lyso-Gb3水平。所有鉴定的变异均通过Sanger测序和家系分离分析验证。对已确诊FD患者的家庭成员，通过Sanger测序筛查已知的GLA变异。对出现无法解释症状（如肢端感觉异常、早发性卒中、肾功能不全或肥厚型心肌病）的患者，使用全外显子组测序或靶向二代测序panel进行调查。最后，对于临床、生化或病理结果提示FD，但在上述检测后未发现GLA编码区致病性变异的患者，采用长读长测序以检测潜在的深内含子或结构变异。所有通过策略3和4鉴定的变异随后均通过Sanger测序验证。
2.4 统计分析
使用SPSS version 31.0进行统计分析。Shapiro-Wilk检验用于评估变量分布。卡方检验用于比较比率。正态分布数据以均值±标准差表示，采用独立样本t检验进行比较。非正态分布数据以中位数（四分位距，IQR）表示，采用Mann-Whitney U检验进行比较。使用Pearson相关系数评估ccf-DNA（ccf-mtDNA、ccf-nDNA和mtDNA/nDNA比值）与临床标志物及炎症细胞因子之间的关联。计算偏相关系数以评估ccf-DNA与炎症细胞因子及临床标志物的关系，并调整性别和年龄。进行受试者工作特征曲线分析以区分初治FD患者与健康对照，计算曲线下面积（area under the curve, AUC）、敏感性和特异性。通过最大化约登指数确定最佳截断值。AUC > 0.5且p<0.05被认为具有诊断价值。采用Benjamini-Hochberg错误发现率方法控制I类错误，并对多重比较的p值进行调整。所有检验均为双尾，统计学显著性设定为p或调整后P-adj<0.05。
3 结果
3.1 队列特征
这项纵向队列研究包括66名FD患者（35名男性和31名女性），来自50个无亲缘关系的家庭，以及21名健康对照（13名男性和8名女性）。FD患者采样时的中位年龄（IQR）为38.50（30.50, 50.00）岁，健康对照为37.00（30.00, 43.50）岁。在66名FD患者中，2名无症状但携带致病性GLA突变且有阳性家族史；其余64名患者的症状发作中位年龄（IQR）为8.50（7.00, 12.75）岁，平均病程为25.70 ± 15.82年。在50个家庭中，GLA测序鉴定出27个错义突变、12个无义突变、3个缺失突变、3个剪接位点突变、1个插入缺失突变、1个重复突变、1个框内移码突变、1个移码突变和1个内含子插入突变。
在37名初治患者、34名接受ERT后的患者以及21名健康对照中定量了血浆ccf-mtDNA（MT-ND1）和ccf-nDNA（ACTB）的绝对拷贝数。在37名初治患者中，16名为男性（13名经典，3名非经典），21名为女性。13名经典男性患者亚组的中位年龄（IQR）为34.50（25.25, 49.50）岁，病程中位数为23.50（10.75, 38.00）年，关键临床特征为HCM（7/13）、CKD（9/13）和缺血性卒中（2/13）。
3.2 FD中的ccf-DNA水平及ERT的影响
与健康对照相比，初治患者的ccf-mtDNA拷贝数和mtDNA/nDNA比值均显著升高，而ccf-nDNA拷贝数无显著差异。在短期ERT组中，ccf-mtDNA和mtDNA/nDNA比值与健康对照相比仍保持升高，ccf-nDNA无差异。在长期ERT组中，ccf-mtDNA与健康对照相比仍保持升高，但mtDNA/nDNA比值不再有显著差异；ccf-nDNA无差异。
此外，比较了短期和长期ERT组之间的ccf-DNA水平。两组之间在ccf-mtDNA、ccf-nDNA或mtDNA/nDNA比值上均未观察到显著差异。
3.3 ccf-DNA的诊断性能
使用受试者工作特征曲线分析验证了ccf-mtDNA对FD的判别潜力。ccf-mtDNA在区分FD患者与健康对照方面表现出中等判别能力（AUC: 0.860）。ccf-mtDNA检测FD的敏感性为70%，特异性为91%；最佳截断值为1,793,188.04拷贝。
相比之下，ccf-nDNA的诊断价值有限，截断值为294.51拷贝时，敏感性为76%，特异性为48%（AUC: 0.584）。mtDNA/nDNA比值提供了高特异性但低敏感性，截断值为8,774.04拷贝时，敏感性为46%，特异性为100%（AUC: 0.708）。
3.4 ccf-DNA与炎症细胞因子的关联
为了探索与炎症的潜在联系，检测了ccf-DNA与炎症细胞因子之间的关联。在37名初治患者中，调整年龄和性别后，mtDNA/nDNA比值与IL-17F和TNF-β呈正相关。未观察到ccf-mtDNA或ccf-nDNA与炎症细胞因子之间的相关性。在13名经典男性FD患者亚组中，调整年龄后，ccf-mtDNA和mtDNA/nDNA比值均与IL-17F和TNF-β显著正相关。相反，ccf-mtDNA与IL-12p70呈负相关。未观察到ccf-nDNA与炎症细胞因子之间的相关性。在女性FD患者亚组中，未观察到ccf-DNA与炎症细胞因子之间的相关性。
3.5 ccf-DNA与临床表型的关联
最后，为了评估ccf-DNA的临床价值，评估了其与临床参数的关系。在37名初治患者中，调整年龄和性别后，在整个队列中未观察到其与疾病持续时间、α-GalA活性或血浆Lyso-Gb3的相关性。在13名经典男性患者亚组中，调整年龄后，也未观察到其与α-GalA活性或血浆Lyso-Gb3的相关性。
在37名初治患者中，调整年龄和性别后，ccf-mtDNA、ccf-nDNA和mtDNA/nDNA比值与临床标志物（包括MSSI、LVMI、eGFR、ACR、PCR、24h-P、Fazekas评分或VAS评分）均无显著相关性。在不同亚组（按性别、GLA突变类型、FD亚型、疾病严重程度或器官受累情况划分）之间，ccf-DNA水平均未发现显著差异。
4 讨论
本研究的关键发现是提供了FD中线粒体损伤的血清学证据。我们确定了FD患者血浆ccf-mtDNA升高和mtDNA/nDNA比值增加，ccf-mtDNA的高AUC支持其作为诊断生物标志物的价值。虽然FD传统上归因于Gb3及其脱酰基形式Lyso-Gb3的累积，但越来越多的证据表明，其他机制也促进了疾病进展，包括氧化应激、能量代谢受损、自噬缺陷和细胞内运输紊乱。线粒体功能障碍，独立于Gb3累积，正成为FD病理学的核心贡献者。
普遍认为Lyso-Gb3是一种良好的生物标志物，并在ERT期间定期监测。在本研究中，我们选择12个月作为界限观察ERT后ccf-DNA的变化趋势。无论是与健康对照相比还是与短期ERT组相比，长期ERT组的ccf-mtDNA水平仍然升高，而ccf-nDNA水平不变；此外，仅长期ERT组的mtDNA/nDNA比值与健康对照相比恢复正常。这些发现可能表明，长期ERT可能通过改善线粒体完整性或减少线粒体损伤的相对贡献，影响细胞损伤的模式，将负担转向核来源。
我们还确定了线粒体损伤与一部分炎症细胞因子之间的关联，表明线粒体功能障碍可能驱动FD中的炎症激活。在溶酶体贮积症中，受损的线粒体自噬导致功能失调的线粒体累积；这些线粒体将mtDNA释放到胞质溶胶中，并通过cGAS-STING通路激活先天免疫信号。一旦触发，该级联反应诱导IFN-β和干扰素刺激基因表达，并促进多种细胞因子的释放，包括I型干扰素、TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6。此外，细胞外ccf-mtDNA可通过Toll样受体9信号进一步放大炎症；mtDNA片段激活内溶酶体膜上的该受体，刺激核因子κB并驱动促炎细胞因子（包括干扰素和IL-1β）的转录。在我们的队列中，ccf-mtDNA在经典男性FD患者中与IL-12p70负相关。这可能反映了一种双相免疫反应，提示IL-12p70在FD中可能发挥保护性促炎作用，值得进一步研究。
尽管ccf-mtDNA表现出高特异性，但其敏感性有限且与疾病严重程度缺乏明确关联，表明它可能作为支持性诊断生物标志物，而非可靠的疾病监测或预后指标。即便如此，这些改变对于理解FD的分子发病机制仍然具有参考价值。我们分析了所有初治FD患者中ccf-DNA与临床标志物的关系。ccf-mtDNA与FD器官受累不直接相关，表明线粒体损伤本身并非FD病理的主要驱动因素。与线粒体病（内在缺陷直接损害细胞功能）不同，ccf-mtDNA可能作为免疫信号的上游触发器，启动放大级联，导致强烈的炎症激活，最终促成靶器官损伤。Gb3在溶酶体中的累积在体外和体内均破坏自噬，阻碍线粒体自噬。泄漏的mtDNA随后激活cGAS-STING通路，诱导促炎细胞因子释放。这些由线粒体损伤次级产生的细胞因子，可能作为直接介质损伤易感器官（如心脏和肾脏），这与我们之前的观察结果一致。
本研究的一个关键方法学考虑涉及用于ccf-DNA分析的方法。两步离心法和基于毛细管电泳的定量（如Bioanalyzer）目前是实现最大血浆纯度和无偏ccf-DNA分析的最佳实践。在我们的方案中，血浆样本在收集后立即处理，并经过反复离心以防止细胞裂解并减少基因组DNA污染，遵循了顺序去除碎片的核心原则。对于定量，我们采用了靶标特异性RT-qPCR定量，这与基于毛细管电泳的片段大小分析和定量不同。我们承认这些先进技术对于无偏探索性研究至关重要。然而，选择RT-qPCR是因为其在检测短片段、位点特异性线粒体和核片段方面具有高特异性，这些是本研究的核心分析物。使用标准曲线进行绝对定量能够灵敏地测量目标基因的可扩增拷贝数。重要的是，基于qPCR的ccf-mtDNA定量方法已成熟建立，并已成功应用于先前的研究，支持该方法对我们研究目标的适用性。此外，保持与我们实验室针对其他神经和神经肌肉疾病（包括肌萎缩侧索硬化症、免疫介导的坏死性肌病和线粒体病）既定工作流程的方法学连续性是一个深思熟虑的选择，因为这种一致性有助于我们研究项目内未来的跨疾病比较。虽然先进技术将为探索性分析提供额外的分辨率，但我们的方案适用于本研究的特定分析目标，未来结合这些最先进方法的工作可能会进一步扩展我们的发现。
4.1 局限性
本研究有几个局限性。由于这是一项探索性研究，且没有先前关于FD中ccf-DNA的数据来指导样本量估算，因此未进行正式的样本量计算；纳入了我们中心所有符合条件的病例。样本量也相对较小，特别是在亚组分析中，这可能会降低统计效力并限制我们将研究结果推广到不同临床环境的能力。此外，尽管我们的数据表明mtDNA释放与炎症激活之间存在联系，但这一因果途径尚未完全确立，需要进一步研究。对潜在机制（如cGAS-STING激活或线粒体自噬受损）的功能验证尚未进行，应在未来研究中解决。
4.2 结论
本研究提供了FD中线粒体损伤及其与炎症激活关联的血清学证据。我们的研究结果支持ccf-mtDNA作为FD有价值的诊断生物标志物。尽管未观察到ccf-mtDNA与疾病负担临床标志物之间的强相关性，但我们的结果与我们之前的发现一起表明，靶向mtDNA诱导的炎症通路可能提供额外的治疗益处。这种方法可能对具有高炎症活性、ERT反应不佳或预后不良的患者特别相关。
