TBX21通过调控Treg/Th17失衡与免疫抑制微环境促进前列腺癌进展

《Frontiers in Oncology》：TBX21 correlates with an immunosuppressive tumor microenvironment and Treg/Th17 imbalance in prostate cancer

本文揭示了转录因子TBX21在前列腺癌（PCa）中通过调控调节性T细胞（Treg）与辅助性T细胞17（Th17）的平衡，塑造免疫抑制肿瘤微环境（TIME）的新机制。研究证实TBX21在PCa中高表达，其敲低不仅抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡，还能逆转免疫抑制状态，增强CD8+T细胞的细胞毒性（如TNF-α、GZMB表达上调），为PCa免疫治疗提供了潜在新靶点。

　　

背景

前列腺癌（PCa）是全球范围内男性中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，给公共卫生带来沉重负担。尽管现有的治疗方法如雄激素剥夺疗法（ADT）和化疗取得了一定成效，但仍有相当比例的患者面临复发和耐药问题。肿瘤免疫微环境（TIME）在PCa的发生发展中扮演着关键角色，其中调节性T细胞（Treg）介导的免疫抑制是肿瘤免疫逃逸的重要机制。转录因子TBX21（编码T-bet）是T-box家族成员，在免疫细胞分化和功能调控中发挥重要作用，但其在PCa免疫微环境中的具体功能尚不清楚。本研究旨在探讨TBX21在PCa进展及其免疫微环境调控中的作用。

材料与方法

研究收集了PCa患者癌组织及癌旁组织样本，通过RNA测序（RNA-seq）筛选差异表达基因。利用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学（IHC）技术在组织和细胞水平验证TBX21的表达。在体外实验中，采用慢病毒介导的shRNA敲低LNCaP和22RV1细胞中TBX21的表达，通过CCK-8法、EdU染色和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡。在体内实验中，构建了22RV1细胞裸鼠移植瘤模型以及人源化免疫细胞重建的移植瘤模型，通过尾静脉注射shRNA慢病毒干预，观察肿瘤生长情况。利用流式细胞术分析肿瘤组织中免疫细胞亚群的比例，包括CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Treg细胞（Foxp3⁺CD4⁺）、Th17细胞（IL17A⁺CD4⁺）以及表达细胞毒性分子（TNF-α、GZMB）的CD8⁺T细胞。同时，检测了免疫检查点分子（PD-1、Tim-3、Lag-3）在T细胞上的表达。通过Transwell共培养系统和条件培养基（CM）实验，探讨了TBX21敲低的肿瘤细胞对初始CD4⁺T细胞向Treg细胞分化的影响，并利用TGF-β中和抗体验证其作用。采用Western blot检测肿瘤组织中STAT1、TNF-α、GZMB、穿孔素（Perforin）等效应分子以及TGF-β、IL-10等抗炎因子和凋亡相关蛋白（Bim、BID、BAD）的表达水平。

结果

TBX21在PCa组织及细胞系中上调

RNA-seq分析显示，与癌旁组织相比，PCa组织中有1779个基因上调，2027个基因下调，其中TBX21显著上调。TCGA-PRAD数据库分析进一步证实了TBX21在PCa肿瘤组织中的高表达，且其高表达与患者较差的总生存期相关。IHC和RT-PCR结果验证了TBX21（T-bet）在PCa组织中的蛋白和mRNA水平均显著高于正常组织。在细胞系中，Western blot结果显示，与正常前列腺上皮细胞RWPE-1相比，PCa细胞系（LNCaP、22RV1、PC3、DU145）中TBX21蛋白表达均升高，尤其在雄激素受体（AR）阳性的LNCaP和22RV1细胞中表达最高。

TBX21促进PCa细胞增殖并抑制凋亡

在LNCaP和22RV1细胞中敲低TBX21后，Western blot证实其蛋白表达被有效抑制。CCK-8实验显示，TBX21敲低显著降低了细胞活力。EdU染色表明细胞增殖能力下降，而流式细胞术 Annexin V分析显示细胞凋亡率增加。这些结果说明TBX21具有促进PCa细胞增殖和抑制凋亡的作用。

TBX21增强体内肿瘤生长

在22RV1细胞裸鼠移植瘤模型中，注射sh-TBX21慢病毒后，肿瘤体积和重量均显著减小。HE染色显示，sh-TBX21组肿瘤组织出现组织疏松和炎性细胞浸润。TUNEL染色显示sh-TBX21组肿瘤细胞凋亡增加，同时IHC检测发现Ki67和T-bet的表达水平下降。

TBX21调控人源化移植瘤模型中的Th17/Treg平衡及CD8⁺T细胞毒性

在人源化免疫细胞重建的22RV1移植瘤模型中，免疫荧光双标证实sh-TBX21处理特异性地降低了肿瘤上皮细胞（EpCAM⁺）中的TBX21表达，而对CD3⁺T细胞内的表达无显著影响。流式细胞术分析显示，sh-TBX21处理后，肿瘤组织中CD4⁺T细胞比例变化不显著，但Th17/Treg比值显著升高，即Treg细胞比例下降，Th17细胞比例上升。同时，表达TNF-α和GZMB的细胞毒性CD8⁺T细胞比例显著增加。然而，表达PD-1、Tim-3或Lag-3的CD4⁺或CD8⁺T细胞比例未见明显变化。

TBX21促进活化CD4⁺T细胞向Treg分化

Transwell共培养实验发现，与TBX21敲低的LNCaP或22RV1细胞共培养后，由活化CD4⁺T细胞分化而来的CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞比例显著降低。条件培养基实验表明，对照肿瘤细胞的条件培养基能诱导Treg分化，而TBX21敲低肿瘤细胞的条件培养基此作用减弱；加入TGF-β中和抗体可部分逆转对照条件培养基的Treg诱导效应，提示TBX21可能通过调节可溶性因子（如TGF-β）影响Treg分化。

TBX21影响肿瘤组织中的抗肿瘤因子水平

Western blot分析显示，在人源化移植瘤模型中，sh-TBX21处理显著上调了肿瘤组织中STAT1、TNF-α、GZMB和穿孔素的蛋白水平，同时下调了抗炎因子TGF-β、IL-10、IL-13和Arg1的表达。此外，促凋亡蛋白Bim、BID和BAD的表达也显著增加。

讨论

本研究系统阐述了TBX21在PCa中的致癌作用及其对免疫微环境的调控。结果表明，TBX21在PCa中高表达，并通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡直接驱动肿瘤进展。更重要的是，TBX21通过塑造免疫抑制微环境间接促进肿瘤生长，具体表现为增加Treg细胞比例、降低Th17/Treg比值、抑制CD8⁺T细胞的细胞毒性功能。共培养和条件培养基实验提示，肿瘤细胞来源的TBX21可能通过分泌可溶性因子（如TGF-β）诱导Treg分化，从而抑制抗肿瘤免疫。该研究为理解PCa免疫逃逸机制提供了新视角，并将TBX21定位为PCa免疫治疗的一个潜在靶点。研究的局限性包括人源化小鼠模型不能完全模拟人体内复杂免疫环境、样本量相对较小等，未来需要在更大临床样本和更深入机制研究中进一步验证。