《Frontiers in Molecular Biosciences》：Hypoxia-induced immunosuppression in uveal melanoma is mediated by CD63+ exosomes delivering lactate to reprogram immune cells
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本研究发现缺氧（1% O2）通过上调CD63表达促进葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞外泌体（exosome）分泌和乳酸富集。这些CD63+外泌体将乳酸递送至免疫细胞，诱导巨噬细胞M2极化（CD206+升高）和CD8+T细胞耗竭（PD-1+TIM-3+增加），并促进免疫抑制因子TGF-β和IL-10分泌。机制上，CD63介导了缺氧诱导的外泌体乳酸穿梭，siRNA敲低CD63可逆转上述效应。该研究揭示了缺氧/CD63/外泌体乳酸轴在UM免疫抑制微环境形成中的关键作用，为靶向该轴增强免疫治疗效果提供了新策略。
单细胞转录组分析揭示CD63与乳酸分布特征
单细胞转录组分析显示，在葡萄膜黑色素瘤（UM）的恶性细胞簇中，乳酸代谢相关基因表达显著升高。高乳酸区域与恶性细胞簇完全重叠，而低乳酸区域主要分布于肿瘤周围的正常细胞簇。进一步分析发现，CD63在免疫细胞的恶性细胞簇中表达显著更高，且与肿瘤细胞中的糖酵解基因（如LDHA和LDHB）呈强正相关。相关性分析表明，CD63表达水平与乳酸浓度升高密切相关。
CD63高表达与囊泡运输功能密切关联
差异表达基因筛选鉴定出178个差异基因，其中144个上调基因包含C1QB、C1QC、C1QA、LIPA等囊泡相关基因及CD63。基因本体（GO）富集分析显示，CD63相关基因显著富集于"囊泡膜"、"细胞外外泌体"等细胞组分，以及"囊泡介导的运输"、"外泌体分泌"等生物过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析进一步证实CD63参与内吞作用、溶酶体通路和细胞外基质受体相互作用等囊泡运输相关通路。
缺氧动态上调CD63表达
为探究缺氧对CD63的调控机制，研究人员将人葡萄膜黑色素瘤细胞系UMT2置于缺氧条件（1% O2）处理12小时。qPCR检测显示，缺氧组CD63 mRNA水平显著高于常氧组（21% O2）。时间梯度实验表明，缺氧处理2小时后CD63 mRNA开始升高，12小时达到峰值。Western blot（WB）分析显示CD63蛋白水平呈现相同变化趋势，2小时开始上升，12小时达到高峰，证实其表达受缺氧动态调控。
缺氧增强肿瘤细胞外泌体分泌能力并促进乳酸富集
通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）定量检测发现，缺氧组外泌体颗粒浓度显著高于常氧组，两组颗粒主要分布于30-150纳米范围，符合外泌体典型特征。透射电子显微镜（TEM）成像显示缺氧细胞来源的外泌体数量更多。代谢物检测揭示缺氧组外泌体乳酸浓度显著增加，而使用CD63特异性siRNA敲低细胞内CD63表达后，缺氧条件下的外泌体乳酸水平明显降低。外泌体抑制剂GW4869（10 μM）处理可完全阻断缺氧诱导的乳酸分泌增加。外泌体标志蛋白WB分析显示，缺氧组外泌体中CD63、Alix和TSG101表达均显著上调，CD63-KD细胞中CD63蛋白几乎检测不到，证实CD63在缺氧诱导的外泌体分泌和乳酸装载中起关键作用。
缺氧外泌体促进CD63依赖性M2巨噬细胞极化及免疫抑制代谢重编程
缺氧外泌体显著诱导巨噬细胞M2极化，表现为CD206+巨噬细胞比例增加，并伴随免疫抑制因子TGF-β和IL-10分泌升高。值得注意的是，这些效应在CD63-KD外泌体组中明显减弱。代谢分析显示，经缺氧外泌体处理的巨噬细胞细胞外酸化率/耗氧率（ECAR/OCR）比值升高，提示糖酵解增强，而CD63-KD外泌体可逆转这一代谢转变。
缺氧外泌体诱导CD63依赖性T细胞耗竭
将人原代CD8+T细胞与巨噬细胞共培养，并分别加入常氧和缺氧肿瘤来源外泌体处理48小时。结果显示，缺氧外泌体处理组PD-1+TIM-3+双阳性细胞比例增加，表明T细胞耗竭状态加剧，同时T细胞杀伤率下降，反映功能受损。这些效应均可被CD63敲低的缺氧外泌体逆转。这些结果共同表明，缺氧外泌体通过CD63依赖性机制驱动T细胞耗竭和细胞毒性丧失，从而将CD63与缺氧黑色素瘤微环境中的免疫逃逸联系起来。
讨论与展望
本研究阐明了一种新型机制：缺氧骨髓瘤细胞通过CD63阳性外泌体转运乳酸，从而重塑免疫微环境。现有文献表明，外泌体标志物CD63在代谢应激条件下表达显著增加。在UM患者中，肿瘤细胞CD63高表达与淋巴结转移风险升高和预后不良呈正相关。作为四跨膜蛋白家族重要成员，CD63在缺氧条件下上调，qPCR和WB结果均证实其在转录和翻译水平显著升高。CD63可能通过稳定ESCRT复合物（TSG101, Alix）增强外泌体生物发生，导致缺氧组外泌体颗粒浓度高于常氧组。缺氧后TSG101、Alix和CD63的上调进一步支持这一发现。
虽然数据证实CD63敲低显著降低外泌体乳酸水平，但CD63促进乳酸富集的具体分子机制仍需深入研究。作为组织膜微结构域的关键四跨膜蛋白，CD63可能通过稳定外泌体膜、促进乳酸转运蛋白（如MCTs）的招募或活性来间接促进乳酸装载。或者，CD63可能通过其与ESCRT机器的相互作用影响乳酸或其调节酶向外泌体的分选。未来研究需要剖析CD63在外泌体代谢物分选中的直接与间接作用。
外泌体乳酸作为细胞间信使的作用在癌症生物学中日益受到关注。在其他实体瘤（如肝细胞癌）中，外泌体乳酸可通过调节外泌体生物发生促进转移；在乳腺癌模型中，外泌体可转移与化疗耐药相关的糖酵解表型。然而，在葡萄膜黑色素瘤这一具有显著内在缺氧和免疫抑制"冷"微环境特征的独特背景下，外泌体乳酸转移的具体机制和后果仍未充分探索。本研究不仅将这一新兴范式扩展至UM，而且独特地确定了缺氧-CD63轴作为关键调节因子。通过将外泌体乳酸装载增加和免疫抑制直接与低氧张力下外泌体四跨膜蛋白CD63的上调联系起来，为理解UM如何利用囊泡通讯维持其免疫豁免生态位提供了新颖的、机制特异性的见解。
乳酸不仅是糖酵解的代谢副产物，更是肿瘤微环境和炎症背景下关键的信号分子和免疫调节剂。其一种新型递送机制涉及外泌体依赖性跨细胞转运。研究结果表明，缺氧条件下产生的
