《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：CGR11 promotes hepatocellular carcinoma progression by regulating autophagy through the PI3K/AKT pathway
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本研究揭示了分泌蛋白CGR11在肝细胞癌（HCC）中的关键作用。通过多组学分析及体内外实验证实，CGR11通过激活PI3K/AKT信号通路抑制细胞自噬，从而促进HCC增殖、侵袭及肿瘤生长。CGR11高表达与患者不良预后显著相关，表明其可作为HCC潜在的预后生物标志物和治疗靶点。
CGR11在肝细胞癌中的表达特征与临床意义
背景
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是原发性肝癌的主要病理亚型，是全球重大的健康负担，其分子机制尚未完全阐明。细胞生长调节因子11（Cell Growth Regulator 11, CGR11）是一种新型的分泌蛋白，其特征是含有EF-hand基序，近年来在肿瘤生物学中作为潜在的细胞外信号调节剂出现。尽管CGR11与癌细胞增殖和转移有关，但其在HCC进展中的确切作用和调控机制尚未被阐明。
方法
研究整合了生物信息学分析、单细胞转录组测序以及基于CellChat的细胞间通讯图谱分析。通过免疫组织化学染色、qRT-PCR和Western blotting在组织微阵列、HCC细胞系和肿瘤标本中验证了CGR11的表达和定位。建立了体外实验、皮下和原位异种移植模型，以评估CGR11过表达和敲低的生物学效应。通过RNA测序、LC3荧光测定和透射电子显微镜来阐明潜在的分子机制。
结果
CGR11在HCC组织中的表达显著高于癌旁组织，且与患者不良预后相关。功能和机制分析表明，CGR11通过激活PI3K/AKT信号通路抑制自噬水平，从而促进HCC细胞增殖、侵袭和肿瘤生长。相反，敲低CGR11在细胞和动物模型中均能恢复自噬并显著抑制肿瘤进展。
CGR11在HCC组织及细胞系中表达上调
通过分析TIMER 2.0、Xiantao Academic、TCGA、GTEx、GEO和CPTAC等多个数据库，发现CGR11在多种人类肿瘤中表达上调，尤其在HCC中，其mRNA和蛋白水平均显著高于正常肝组织。对包含100对临床标本的组织微阵列进行免疫组织化学分析，以及Western blot和qRT-PCR验证14对配对组织，均证实CGR11在HCC组织中表达升高。在HCC细胞系（如Hep3B、HCC-LM3、MHCC-97H、SNU449）中，CGR11的表达也高于正常肝细胞THLE-2。
CGR11表达与肿瘤微环境及预后的关联
单细胞转录组数据分析显示，CGR11主要在恶性肝细胞中表达，在免疫细胞和基质细胞中表达较低。对恶性细胞亚群的分析发现，CGR11高表达的细胞簇（如cluster 8）富集了PI3K/AKT、MAPK信号通路、自噬、氧化磷酸化和蛋白输出等相关通路。细胞通讯分析表明，CGR11高表达的肿瘤细胞通过CD6、CD46、MIF、VEGF和TRAIL等配体-受体对与肿瘤相关巨噬细胞、T细胞等免疫成分存在强烈的相互作用。DNA甲基化分析显示，HCC组织中CGR11的甲基化水平降低，低甲基化与较差的生存预后相关。
生存分析表明，CGR11高表达的HCC患者总生存期、无复发生存期和疾病特异性生存期均较短。多因素Cox分析确认CGR11是HCC患者不良预后的独立危险因素。免疫浸润分析进一步提示，CGR11高表达 combined with CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和髓源性抑制细胞浸润水平高，预示着更差的预后。
CGR11促进HCC细胞恶性表型
在体外功能实验中，敲低CGR11（使用MHCC-97H细胞）显著抑制了细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力，并促进了细胞凋亡。而过表达CGR11（使用PLC/PRF/5细胞）则表现出相反的效应，增强了这些恶性表型。这些结果通过CCK-8实验、Edu incorporation实验、划痕愈合实验、Transwell小室实验和流式细胞术等多种方法得到了验证。
CGR11促进HCC体内肿瘤生长
通过建立裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤模型，进一步验证了CGR11的促癌作用。敲低CGR11显著减小了肿瘤的体积和重量，而过表达CGR11则显著促进了肿瘤的生长。原位模型通过活体荧光成像也证实了CGR11敲低抑制了肝内肿瘤的生长。对移植瘤组织的免疫组化分析显示，CGR11表达与增殖细胞核抗原（PCNA）的表达呈正相关。
CGR11通过PI3K/AKT通路影响HCC细胞功能
为了深入探讨CGR11的作用机制，对CGR11敲低的MHCC-97H细胞进行了RNA测序分析。火山图和层次聚类热图显示了敲低组与对照组之间的基因表达差异。KEGG和基因集富集分析结果均显著富集到PI3K/AKT、MAPK和自噬等相关通路。基因本体论富集分析提示CGR11参与调节细胞对外界刺激的反应、细胞-基质相互作用和跨膜运输等过程，且主要定位于细胞膜。Western blot验证证实，敲低CGR11降低了磷酸化PI3K和磷酸化AKT的水平，而过表达CGR11则增加了它们的水平。对异种移植瘤组织的免疫组化染色也显示CGR11表达与p-PI3K、p-AKT、LC3和p62的表达存在相关性。
CGR11抑制HCC细胞自噬
公共数据库分析显示CGR11表达与自噬标志物（如LC3、p62/SQSTM1）呈负相关。使用mRFP-GFP-LC3双荧光报告系统检测自噬流，发现CGR11过表达减少了自噬流（黄色斑点和红色斑点的比例变化），而敲低CGR11则增强了自噬流。Western blot分析表明，敲低CGR11增加了LC3-II的水平并降低了p62的水平，过表达则相反。透射电子显微镜观察也发现，敲低CGR11的细胞中自噬体数量增多，而过表达CGR11的细胞中自噬体数量减少。这些结果共同表明CGR11抑制了HCC细胞的自噬。
CGR11通过PI3K/AKT通路调控自噬
鉴于PI3K/AKT通路是自噬的经典负调控通路，研究进一步使用AKT激活剂SC79和抑制剂MK2206进行验证。在CGR11敲低的细胞中，SC79处理恢复了p-AKT水平，并挽救了因CGR11敲低而受抑制的细胞增殖、迁移和侵袭能力，同时抑制了自噬。相反，在CGR11过表达的细胞中，MK2206处理降低了p-AKT水平，逆转了CGR11过表达带来的促增殖、迁移和侵袭效应，并恢复了自噬水平。LC3双荧光报告实验和透射电镜结果也支持了这一结论。这些结果表明，CGR11是通过激活PI3K/AKT信号通路来抑制自噬，进而促进HCC的进展。
讨论
本研究通过综合的生物信息学分析、体外细胞实验、动物模型以及分子机制探索，系统地阐明了CGR11在HCC中的致癌作用。CGR11在HCC中高表达，与不良预后相关，并通过激活PI3K/AKT通路抑制自噬，从而促进肿瘤生长和侵袭。PI3K/AKT通路是HCC中重要的致癌信号通路，其异常激活与肿瘤进展、转移和耐药密切相关。自噬在HCC中扮演着双重角色，在肿瘤晚期，其抑制往往有利于肿瘤的生存和发展。本研究揭示了CGR11-PI3K/AKT-自噬轴在HCC进展中的关键作用，为理解HCC的分子机制提供了新的视角。CGR11有望成为HCC潜在的预后生物标志物和治疗靶点。未来的研究可以进一步探索CGR11表达上调的调控机制，以及其在肿瘤微环境重塑和代谢重编程中的作用。
结论
本研究证实CGR11通过激活PI3K/AKT信号通路抑制细胞自噬，从而促进肝细胞癌的进展。CGR11的高表达与患者不良预后相关，提示其作为HCC预后生物标志物和治疗靶点的潜在价值。靶向CGR11-PI3K/AKT轴可能为HCC的精准治疗干预提供新的途径。
