《Frontiers in Plant Science》：Whole-genome identification of LdELF4s and analysis of their expression response to diurnal temperature variations in Lilium davidii var. willmottiae (E. H. Wilson) raffill
1 Introduction
全球气候变暖导致极端天气事件频发，温度波动成为植物生长过程中不可避免的环境胁迫因子。昼夜温差（DIF）不仅影响植物发育进程，更显著制约其产量与品质。相较于最适DIF下栽培的植物，经历亚最适昼夜间温度（如夜间高温或低温胁迫）的植株其生理功能会受到干扰。偏离物种特异性最适温度范围会通过扰动内源激素稳态、光合碳分配及碳氮代谢途径，改变表型可塑性与生态适应性。
兰州百合（Lilium davidii var. willmottiae）作为中国特有的药食同源植物，其鳞茎合成生物活性化合物的过程受DIF调控。ELF4（EARLY FLOWERING 4）基因家族是协调内源节律与外界环境变化的关键调控因子，然而该基因家族在该物种中尚未被探索。黄昏时，ELF3作为支架蛋白，与ELF4和LUX（LUX ARRHYTHMO/PHYTOCLOCK 1）形成夜晚复合体（EC），其活性在夜间达到峰值，发挥强效转录抑制功能。光与温度均能调控EC活性及其与靶基因的结合亲和力，中度高温度抑制EC活性，而中度低温度则增强其活性，这一调控机制使植物能够感知昼夜温度波动并精确调控下游基因，从而调节植物生长发育。
2 Materials and methods
研究选取了12个物种（包括拟南芥、玉米、小麦、番茄、大豆、葡萄、毛果杨、小立碗藓、大蒜、兰州百合、卷丹百合和泸定百合）作为研究对象。从phytozome数据库及已发表文献获取基因组注释文件，提取最长转录本亚型的编码序列（CDS）和蛋白质序列。使用OrthoFinder2对12个物种的蛋白质序列进行全基因组直系同源群（OG）分析，筛选单拷贝OG用于后续分析。通过MAFFT进行多序列比对，trimAI修剪保守位点。将各物种单拷贝基因序列串联整合，使用IQ-TREE构建最大似然（ML）系统发育树，以小立碗藓为外群。
从NCBI细胞器基因组数据库获取12个物种的完整叶绿体基因组序列，同样使用MAFFT比对、trimAI修剪后，用IQ-TREE构建ML系统发育树以验证物种间质体基因组的进化关系。
以拟南芥ELF4蛋白质序列为参考，确定蛋白质家族Pfam ID PF07011.16。基于隐马尔可夫模型（HMM）序列标识符进行全基因组搜索，鉴定所有ELF4家族成员。通过SMART数据库和NCBI保守结构域数据库（CDD）验证蛋白质是否包含DUF1313结构域。使用ExPASy ProtParam工具分析ELF4蛋白质的理化性质，并通过Softberry的ProtComp工具预测其亚细胞定位。
利用ELF4的Pfam ID在11个物种（包括兰州百合、泸定百合、嘉兰百合、拟南芥、大豆、毛果杨、番茄、葡萄、水稻、玉米和大蒜）基因组中鉴定ELF4家族成员。使用MEGA11软件的ClustalW比对蛋白质序列，采用Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型，通过邻接法（NJ）进行1000次bootstrap重复评估树的可信度。
下载兰州百合和泸定百合的全基因组序列及gff3注释文件，使用BEDtools和seqkit工具处理，利用jcvi工具集的JCVI-compara子命令生成锚点文件，最终通过jcvi.graphics.karyotype模块绘制共线性图。
使用MEME预测ELF4s的保守基序，设置基序数为6，宽度范围6-50。利用CDD获得保守结构域信息，结合gff3和Newick文件通过TBtools可视化。通过PlantCARE网站预测ELF4s转录起始位点（TSS）上游2000 bp启动子序列的顺式作用元件，并对预测结果进行分类统计。
从先前研究获取兰州百合参考基因组及相应基因注释文件，使用gffread工具提取转录本序列，Salmon构建映射索引并量化转录本表达量，以TPM（transcripts per million）值通过TBtools可视化目标基因的组织特异性表达谱。
将兰州百合幼苗移栽至育苗盘，在生长箱中于恒定昼夜温度20°C（昼/夜20/20°C）、12小时光周期下培养至出苗。将生长一致的幼苗随机分为三组（每组n=10）：对照组维持20/20°C，两个处理组分别暴露于25/10°C和20/5°C的昼夜温度 regimen。处理组接受相应温度处理14天。在三个时间点采集植物组织样品：处理开始后7天（7 dpt）、14天（14 dpt）和处理结束后7天（7 dptc）。样品立即用液氮速冻，研磨成细粉后使用商业试剂盒提取总RNA。评估RNA纯度和浓度后，合格RNA反转录为cDNA，稀释至50 ng/μl工作浓度作为qRT–PCR模板。
使用Primer Premier 5软件设计六个候选基因（LdELF4s）和内参基因（LdActin）的特异性qPCR引物。在不同昼夜温度处理下，使用QuantStudio? 5实时PCR系统量化每个候选基因的转录丰度。根据原始Ct值，采用2?ΔΔCt法计算相对基因表达水平，以内参基因的几何平均数标准化。通过单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验确定各时间点处理组间基因表达的显著差异，显著性阈值设为P < 0.05。
3 Results and analysis
3.1 Cytonuclear discordance during the evolution of lilies
为探究三种百合（兰州百合、泸定百合和嘉兰百合）在进化过程中的系统发育关系，研究汇总了12个物种的554,748个基因比对序列，划分为55,446个OG，其中5,603个OG为12个物种所共享。基于32个单拷贝OG构建的核基因组系统发育树显示，单子叶植物与双子叶植物明显分化。六种单子叶植物（玉米、水稻、大蒜及三种百合）形成独立谱系，鳞茎类物种聚为一个独立亚支。相比之下，叶绿体基因组系统发育关系显示鳞茎类物种间进化关系高度保守，但与其他物种相比存在显著的拓扑结构差异。与核基因组相比，这种核质系统发育不一致可能源于叶绿体基因组的母系遗传及其独特的进化速率/选择压力。
分子钟模型结合化石校准估算百合属物种的分化时间线。鳞茎植物与禾本科（ grasses）的分化发生在大约1.3亿年前（Mya）。兰州百合/嘉兰百合谱系与泸定百合的分化时间为85.7 Mya，而物种水平的分化延迟至22.5 Mya。基因家族动态分析揭示了兰州百合（1,552个扩张和1,797个收缩基因家族）和泸定百合（1,421个扩张和1,927个收缩家族）的趋同进化模式，而嘉兰百合则呈现相反趋势。这些差异可能源于全基因组复制（WGD）事件的异质分布、物种特异性选择压力以及基因组组装完整性差异可能引入的偏差。
3.2 Phylogenetic analysis of the ELF4 protein in lilies and other species
为阐明百合基因在不同物种中的进化过程，基于基因扩张/收缩动态，选择ELF4家族作为研究目标。通过Pfam ID（PF07011.16）HMM谱和保守结构（ELF4结构域）系统鉴定了百合中18个ELF4同源物。根据基因组注释文件重命名了17个基因的ID，包括兰州百合中的6个（LdELF4.1-LdELF4.6）、泸定百合中的6个（LsELF4.1-LsELF4.6）和嘉兰百合中的5个（GsELF4.1-GsELF4.5）。此外，在其他8个物种中鉴定出ELF4基因，包括拟南芥（5个）、大豆（10个）、毛果杨（7个）、番茄（7个）、葡萄（4个）、水稻（3个）、玉米（4个）和大蒜（5个）。
进化树结果表明，62个ELF4蛋白可分为四个亚家族。亚家族III包含的蛋白数量最多，总计31个ELF4蛋白，包括来自百合属的5个GsELF4s、6个LdELF4s、5个LsELF4s和5个AsELF4s，以及来自单子叶植物的4个ZmELF4s和3个OsELF4s。亚家族II和IV包含数量相近的蛋白，主要由双子叶植物的ELF4s组成，如GmELF4s、AtELF4s、VvELF4s和PtELF4s。相比之下，亚家族I包含的蛋白最少，仅有一个蛋白AtELF4.4。研究结果还表明兰州百合与嘉兰百合亲缘关系最近，其次为泸定百合。此外，观察到兰州百合与大蒜、水稻和玉米相对亲缘较近。这些结果提示百合中的ELF4蛋白在进化过程中保持相对保守，且与单子叶植物的ELF4蛋白亲缘关系近于双子叶植物。
3.3 Chromosomal distribution and evolutionary analysis of ELF4s in lilies
为阐明ELF4s在基因组中的分布，研究可视化了三种百合的染色体定位。结果显示，LdELF4s主要分布在四条染色体上，且均位于染色体中部。其中，LdELF4.1和LdELF4.2分别位于LG01和LG08，其余四个基因相对集中在LG09和LG12。LsELF4s同样分布在四条染色体上，位于染色体两端，共有四个基因存在于5号和10号染色体上。GsELF4s分布在大基因组片段上；GsELF4.1至GsELF4.4聚集在Scaffold 19上，GsELF4.5位于Scaffold 28上。
为展示百合物种间的复制和重排，对兰州百合和泸定百合进行了共线性分析。结果表明，在泸定百合进化过程中可能发生了染色体片段易位或融合事件；此外，这些事件也是基因组分化的重要标志。
3.4 Analysis of the functional and structural characteristics of the ELF4s in lilies
为理解百合ELF4家族的整体特征，使用ExPASy ProtParam分析了三种百合物种该基因家族成员的理化性质。结果显示，不同百合物种的蛋白质长度差异显著。嘉兰百合的氨基酸序列最长（100-890 aa），泸定百合的最短（69-198 aa），兰州百合的蛋白质长度居中（100-139 aa）。等电点分析显示，兰州百合蛋白质的等电点分布范围相对较宽，酸性范围从4.47到11.22（3个酸性和3个碱性），而嘉兰百合的蛋白质除GsELF4.5外均呈弱碱性。泸定百合的所有蛋白质均表现出碱性特征。所有成员的GRAVY指数均为负值，表明该家族蛋白质总体上是亲水的，其中泸定百合的蛋白质亲水性最强。稳定性系数表明，除LdELF4.6和LdELF4.4外，百合ELF4蛋白家族的所有成员均不稳定。此外，发现该家族中没有一个蛋白质具有跨膜结构域。亚细胞定位分析和预测表明，大多数ELF4蛋白定位于细胞核，GsELF4.2定位于叶绿体，LsELF4.3和LsELF4.4分别定位于线粒体和细胞质。这些发现表明ELF4蛋白可能在调控基因表达中发挥关键作用。
3.5 Domain, gene structure and conserved motif analysis of the ELF4s in lilies
对百合ELF4结构域、基因结构和保守基序的深入分析揭示了这些发现。大多数ELF4s具有一个保守的ELF4结构域。除了属于ELF4超家族并可能共享一些保守结构域的LdELF4.5外，GsELF4.4还包括六个其他结构域，可能参与调控其他基因的功能。基因结构表明，12个ELF4s中仅有一个外显子。GsELF4.1和GsELF4.3均包含三个外显子，而GsELF4.2和GsELF4.4分别包含两个和五个外显子。这些结果表明百合ELF4基因家族成员结构简单，编码具有单一功能的蛋白质。
随后进行多序列比对以鉴定保守基序，发现ELF4结构域高度保守。ELF4s中的基序数量从3到6个不等。该观察结果突出了对这些基因生物学功能至关重要的关键功能结构域。
3.6 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of LdELF4s in Lanzhou lily
为分析LdELF4s启动子区域顺式作用元件在植物生长发育中的潜在调控功能，本研究从基因组中提取了LdELF4s转录起始位点（TSSs）上游2000 bp区域。顺式作用元件的分类和统计显示，这些序列可响应14种调控功能，主要富集了三大类功能元件：生长和发育相关元件（如ARE、circadian和GCN4_motif）；植物激素响应元件——脱落酸（ABA）响应元件、赤霉素（GA）响应元件（包括P-box和TATC-box）和茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件；以及胁迫响应元件（如LTR和TC-rich repeats）。值得注意的是，所有LdELF4启动子都配备了光响应元件和胁迫防御元件。大多数启动子包含多个植物激素响应模块；一些序列包含生长和发育特异性调控元件（如昼夜节律元件）。胁迫响应元件在LdELF4.1、LdELF4.2、LdELF4.3和LdELF4.4中占比最大，而在LdELF4.5和LdELF4.6中，占比最大的元件是生长发育响应元件。此外，发现LdELF4.4响应四种激素刺激，而LdELF4.2响应五种不同的非生物胁迫。
总之，启动子区域多种元件的富集模式表明LdELF4可能通过整合光信号、激素途径和胁迫响应网络参与调控植物生长发育。
3.7 Analysis of Lanzhou lily phenotypes under various diurnal temperature differences
以20/20°C（昼/夜）作为标准萌发温度并设为对照，观察到与25/10°C和20/5°C两个处理组相比，植株高度显著增加。在25/10°C处理下，植株生长稳定，叶片形态紧凑。相比之下，在20/5°C处理下，生长发育延迟，导致株高显著降低。此外，处理结束后七天，处理组与对照组之间的株高差异逐渐缩小。这些发现表明DIF可能影响植物生长发育。
为探究不同昼夜温度对兰州百合生殖生长的影响，本研究在开花期测量了相关指标。结果显示，在植物生长发育后期，不同昼夜温度处理间株高无显著差异，但开花时间显著延迟。其中，在25°C/10°C和20°C/5°C处理下，平均花期分别延迟了12.5天和7.8天。在25°C/10°C下，茎粗显著增加了0.7毫米，而在20°C/5°C下，茎粗减少了0.55毫米。此外，20°C/5°C处理下的花蕾总数最多，而25°C/10°C处理下的花蕾数量最少。此外，对鳞茎重量和可溶性糖含量（鳞茎营养积累的关键指标）的测量提供了更深入的见解。25/10°C处理导致鳞茎鲜重（10.45克）和可溶性糖含量（30.09毫克/克）最高，显著超过对照（20/20°C：8.54克，22.47毫克/克）。相比之下，与对照处理相比，20/5°C处理的鳞茎重量为8.97克，糖含量为24.62毫克/克，效果不那么明显。这些结果表明，尽管25°C/10°C的昼夜温差延迟了开花并减少了花蕾数量，但它显著促进了茎的增粗，并有利于鳞茎生物量和糖分的积累。因此，适当的昼夜温差组合可能促进兰州百合鳞茎的发育。
3.8 Investigation of expression patterns in the Lanzhou lily across various conditions
基于已发表的兰州百合不同组织转录组数据分析，LdELF4.1在所有检测组织中组成型高表达。相比之下，LdELF4.3表现出显著的组织特异性，仅在花瓣中检测到显著上调，而LdELF4.4在花药中特异性高表达。这些发现为深入研究LdELF4基因家族成员的功能分化奠定了坚实基础。
此外，为探究ELF4家族成员对DIF的响应机制，利用qRT–PCR系统分析了兰州百合中六个LdELF4s在不同昼夜温度 regimen 和处理持续时间下的表达动态。结果表明，在温度胁迫早期（7天和14天），LdELF4表达水平普遍较低，提示LdELF4s可能尚未完全激活或最初维持基础表达水平。然而到第21天，总体表达显著增加。值得注意的是，在不同温度处理下，基因成员间出现了不同的时间表达模式：在25/10°C regime 下，LdELF4.1、LdELF4.3和LdELF4.6的表达从第21天开始迅速增加。相比之下，在较低的夜间温度处理（20/5°C）下，这三个基因的表达显著提前增加，在第14天达到峰值，表明这三个基因的表达受低温胁迫诱导。LdELF4.4和LdELF4.5在两种昼夜温度处理下均在第21天表达迅速增加，表明对温度变化无显著响应。LdELF4.2与上述基因不同，在两种温度 regimen 下均在第14天表达迅速增加，类似于对DIF缺乏特异性响应。总体而言，LdELF4.6对DIF变化的响应表达模式最为敏感，提示其可能作为兰州百合适应昼夜温度波动和生长调控的关键调节因子。
4 Discussion
4.1 Nuclear and cytoplasmic anomalies during the process of species evolution
植物进化涉及三个独立遗传系统：核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组的协同进化。迄今为止，研究主要集中在叶绿体和核基因组的独立系统发育分析。基于组装的基因组数据，本研究系统比较了多个百合属物种、大蒜以及代表性单子叶和双子叶植物的核基因组和叶绿体基因组的系统发育拓扑结构，并探讨了这些物种间存在的细胞核与细胞质不一致现象。
与被子植物中广泛报道的一致，观察到核基因组与叶绿体基因组之间存在显著的不一致。基于核基因组的系统发育符合预期的进化规律：以小立碗藓为外群，被子植物清晰地分为单子叶植物和双子叶植物支。在此框架内，三种百合和大蒜表现出密切的亲缘关系，支持了先前关于百合科与石蒜科姐妹关系的结论。对核和叶绿体系统发育树的成对比较揭示了一个由三种百合和大蒜组成的特定亚支，表现出显著的细胞核与细胞质不一致。该亚支在核树和质体树中的系统发育位置均不同于单子叶植物与双子叶植物谱系的主要分化。这一发现可能源于叶绿体基因组相对保守，但其多样性低于核基因组。值得注意的是，先前百合属叶绿体基因组的系统发育研究大多局限于百合科内或属内水平。本研究首次在包含多样化代表性单子叶和双子叶植物的更广泛进化框架内重建了它们的系统发育。对该关键谱系（百合-大蒜支）的分化时间估算支持其早期历史以相对快速的辐射事件为特征。这种快速多样化过程可能伴随着杂交事件和不完全谱系分选（ILS）；其他机制也可能导致这种现象。例如，杂交后的叶绿体捕获可能导致一个物种的叶绿体基因组在另一个物种的核背景中固定，产生不一致的系统发育信号。此外，快速进化的核基因组与更保守的叶绿体基因组之间的差异进化速率可能导致不一致的树拓扑结构。同样重要的是要考虑方法学上的假象，可能因当前可用的百合基因组取样有限而加剧，可能影响深部分支的分辨率。虽然现有框架内的数据最好地支持涉及杂交和ILS的情景，但未来扩大分类学取样的研究对于完全厘清这些替代假说的相对贡献至关重要。
4.2 Evolutionary relationships of the ELF4 family
ELF4基因对于植物的光周期感知、生物钟调节、温度响应和节律维持不可或缺，并在整个进化过程中高度保守。本研究基于其特征性DUF1313结构域在不同物种中鉴定了ELF4家族成员，发现成员数量存在波动，主要在3到10个之间。这种变异可能与物种间选择速率或进化压力的差异有关。在兰州百合中鉴定出6个LdELF4家族成员，这一数量与其二倍体进化模式一致。系统发育分析将ELF4家族分为四个不同的亚支。亚家族II主要由双子叶物种组成，可能反映了其共同祖先的特征。相比之下，亚家族III主要由单子叶物种组成，聚类分支既连续又分散，表明ELF4结构域本身相对保守和古老。ELF4s在不同亚支的分布模式提示潜在的功能分化，表明同一亚家族内的基因可能因其密切的进化关系而具有相似功能。
染色体定位揭示了所研究的三种百合物种中ELF4家族成员在染色体上的不均匀分布。值得注意的是，兰州百合和泸定百合的分布模式高度相似，为它们密切的进化亲缘关系提供了进一步证据。嘉兰百合ELF4s仅定位于scaffold序列而非组装染色体，可能归因于缺乏染色体水平的基因组组装。全基因组共线性分析揭示了兰州百合与泸定百合之间存在显著的共线性关系，一些染色体呈现规则对应； notably，在兰州百合的LG08与泸定百合的Chr5之间鉴定出大量共线性区块。大多数ELF4家族成员仅包含2-3个外显子。密切相关的基因间外显子-内含子结构的相似性与其在蛋白质系统发育树中的高度同源性一致，表明这些结构元件在进化过程中具有一定保守性。此外，在进化过程中内含子的获得是普遍现象，增加了基因结构复杂性以适应多样化变化。兰州百合ELF4s启动子区域内顺式作用
