TPM1-p.E181K突变通过抑制CaMKII/HDAC4信号通路导致儿童限制型心肌病的机制研究

《Frontiers in Genetics》：TPM1-p.E181K mutation suppresses CaMKII/HDAC4 signaling pathway leading to pediatric restrictive cardiomyopathy

本研究首次报道了TPM1基因p.E181K（Glu181Lys）突变与散发性限制型心肌病（RCM）的关联，通过体外功能实验证实该突变通过破坏细胞内钙稳态，进而抑制CaMKII（钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II）/HDAC4（组蛋白去乙酰化酶4）磷酸化级联反应，最终导致肌节结构紊乱和心肌高收缩性，为RCM的精准诊疗提供了新的分子靶点和理论依据。

　　

背景

限制型心肌病（RCM）是一种以舒张功能受损、收缩功能保留、左心房或双心房扩大、心房压力升高以及心室壁厚度正常或接近正常为特征的罕见心肌病。尽管RCM在儿童心肌病中占比不高（约2%–5%），但其预后极差，儿科患者2年死亡率高达50%，给家庭和社会带来沉重负担。RCM具有显著的遗传异质性，目前已报道超过19个疾病相关基因，主要编码肌节蛋白（如TNNI3、TNNT2、TNNC1、TPM1、MYH7等）和非肌节蛋白（如TTN、DES、FLNC等）。TPM1基因编码α-原肌球蛋白链，其突变在肥厚型心肌病（HCM）和扩张型心肌病（DCM）中已有明确致病性，但与RCM的确切致病证据仍极为罕见，其具体分子机制尚不清楚。

材料与方法

本研究对象为一例11岁男性散发性RCM患者，无心肌病家族史。通过全外显子组测序（WES）在患者中发现TPM1基因的de novo杂合错义突变（NM_001018005.2:c.541G>A, p.Glu181Lys）。为验证其致病性及探索机制，研究构建了TPM1野生型（WT）和p.E181K突变型质粒，转染至AC16人心肌细胞系。采用蛋白质三维建模预测突变引起的结构改变；通过定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blotting, WB）分析基因和蛋白表达水平；使用Rhod-2 AM荧光探针检测细胞内钙瞬变；通过Phalloidin-488染色评估F-肌动蛋白细胞骨架重组；并利用磷酸化特异性抗体评估CaMKII/HDAC4信号通路关键组分及肌钙蛋白（Tn）的磷酸化状态。

结果

RCM家系与先证者临床表型

先证者为11岁男性，临床评估显示身材矮小（身高125 cm，<3rd百分位数）。家系分析及Sanger测序证实TPM1 c.541G>A (p.Glu181Lys)突变为de novo杂合突变。心脏MRI显示双心房扩大，超声心动图显示左心房明显扩张伴轻度右心房扩大，心电图显示窦性心律伴V₄-V₆导联ST段压低>0.15 mV及QTc间期延长至477 ms。二尖瓣血流E/A比为1.7，提示舒张功能障碍。该表型符合散发性限制型心肌病（RCM）诊断标准。

TPM1-p.E181K突变的结构影响

多维计算分析显示，p.Glu181Lys突变导致关键氢键网络重构，可能破坏α-螺旋结构完整性。SOPMA二级结构预测显示突变体α螺旋比例增加（98.59%增至98.94%），无规卷曲含量降低（1.41%降至1.06%），表明结构刚性增加。表面静电势分析显示，野生型Glu181带强负电荷（-8 kT/e），而突变型Lys181带正电荷（+6 kT/e），破坏了肌动蛋白结合界面的静电互补性。

TPM1-p.E181K对基础表达及钙稳态的影响

qPCR和Western blot分析表明，突变并未改变TPM1的mRNA和蛋白表达水平。比色法ATP测定显示突变细胞与野生型细胞ATP含量无显著差异，表明对能量代谢稳态无直接影响。然而，Rhod-2 AM荧光探针检测显示，突变细胞内Ca²⁺浓度显著降低，荧光强度定量分析（积分光密度, IOD）显示野生型为5352.04 ± 943.84，突变型为1844.7 ± 271.06 (P < 0.0035)，表明存在病理性钙调节异常。

TPM1-p.E181K对CaMKII/HDAC4磷酸化级联的抑制

Western blot定量分析显示，与野生型相比，突变细胞中CaMKII的磷酸化水平显著降低（P = 0.021），HDAC4的磷酸化水平降低更为显著（P = 0.0003）。机制上，钙信号减弱损害了CaMKII激酶活性，从而抑制了HDAC4的磷酸化。

肌钙蛋白磷酸化受损验证收缩调节异常

磷酸化肌钙蛋白I（p-TnI）表达在突变细胞中降低了57.3% ± 11.9% (P = 0.0084)，表明TPM1突变通过CaMKII-TnI信号轴破坏了肌丝收缩调节。

心肌细胞病理性重塑的形态学证据

Phalloidin-488/DAPI共聚焦成像显示，突变细胞表面积显著增加（野生型：681.3 ± 92.0 μm²vs 突变型：2073.6 ± 182.1 μm², P = 0.0003），提供了心肌细胞病理性肥大的直接形态学证据。

讨论

原肌球蛋白（TM）是一种由两条α螺旋链形成卷曲螺旋结构的肌动蛋白结合蛋白，是肌肉收缩的关键调节因子。TPM1-p.E181K错义突变位于15号染色体外显子5（第181位氨基酸/共284个氨基酸），处于保守的原肌球蛋白功能域（肌动蛋白结合关键区域）。根据ACMG指南，该变异被归类为可能致病性。

功能上，TPM1-p.E181K突变显著抑制了CaMKII和HDAC4的磷酸化。研究提出钙稳态失调是驱动此信号抑制的关键上游事件。机制可能涉及两个方面：胞质Ca²⁺水平降低直接抑制CaMKII自身磷酸化；肌钙蛋白I磷酸化减少可能损害CaMKII在肌节处的支架或变构激活。 consequently，HDAC4低磷酸化预计会促进其核积聚。HDAC4的核积聚已知会抑制对心脏舒张重要的基因（如KLF4和SERCA2a）的转录。因此，该信号级联可能是TPM1-E181K突变与RCM特征性舒张功能受损之间的潜在机制联系。

与主要报道于肥厚型（HCM）和扩张型心肌病（DCM）的其他TPM1突变不同，本研究在临床RCM背景下揭示其独特致病性是通过特异性破坏钙-CaMKII-HDAC4信号轴介导的。该突变虽不改变TPM1表达水平，但损害肌钙蛋白磷酸化，显著降低钙亲和力并减小细胞内Ca²⁺瞬变幅度。此表型与Dorsch等人报道的由TPM1复合杂合突变（E62Q/M281T）引起的RCM有根本区别，表明不同TPM1结构域的突变通过不同的分子机制驱动表型异质性，提示独特的信号网络是RCM发病机制的基础。

基于本研究结果，靶向激活CaMKII或抑制HDAC4核转位可能成为潜在的治疗途径。未来的研究需要通过对该通路进行干预来功能性地评估病理表型的逆转，以验证这些靶点并克服当前的治疗局限性。