《Frontiers in Molecular Biosciences》：Forsythiaside a facilitates autophagy to ameliorate chronic nonbacterial prostatitis in rats by blocking the PKCα/NF-κB pathway
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本文研究发现，天然活性成分连翘酯苷A（FTA）能够通过阻断蛋白激酶Cα（PKCα）/核因子κB（NF-κB）信号通路，促进自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3B（LC3B II/LC3B I）的表达，并下调白细胞介素1β（IL-1β）、IL-2、IL-6、IL-17A、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子水平，从而显著减轻完全弗氏佐剂（CFA）诱导的大鼠慢性非细菌性前列腺炎（CNP）的组织损伤和炎症浸润，为CNP的治疗提供了新的潜在策略。
引言
慢性非细菌性前列腺炎（CNP）属于III型前列腺炎（慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征），是一种在男性中高发的泌尿系统疾病，占临床前列腺炎病例的90%以上，严重影响生活质量和心理健康。尽管CNP的病因和发病机制尚不明确，但针对自身免疫的炎症反应已被证实在其发展过程中起关键作用，并影响前列腺功能。目前，药物治疗（如α受体阻滞剂和抗炎药）仍是CNP临床管理的主要手段，但疗效有限且不尽如人意，因此开发新的有效疗法至关重要。
自噬是一种涉及质量控制、代谢和免疫的基本细胞过程，在疾病中扮演复杂且情境依赖的角色。自噬失调与多种病理相关；例如，过度的自噬会促进细胞凋亡，从而加重非小细胞肺癌，因此精确控制自噬至关重要。作为一种细胞降解途径，自噬可以保护细胞免受外源性危害和内源性炎症来源的侵害。在正常生理条件下，自噬维持在较低水平，其功能障碍常与人类疾病中失调的炎症相关。在前列腺病理学研究中，焦点已从癌症扩展到细胞衰老等机制，但自噬在CNP等炎症状态下的调控机制仍不清楚。鉴于越来越多证据强调自噬在CNP中的重要作用，推测药物调节自噬活性可能为阻止病情进展提供有吸引力的治疗候选方案。这一发现在当前精准靶向关键信号通路的研究时代尤为关键。
临床上，抗生素、α受体阻滞剂、非甾体抗炎药和植物治疗剂常被用于治疗CNP，但其效果不一。近年来，中药被报道能以较小的副作用为CNP提供有效治疗。一个代表性例子是解毒活血汤，这是一种由十种不同中草药组成的经典方剂，对CNP大鼠具有强效抗炎作用；然而，其具体的草药活性成分仍有待阐明。连翘酯苷A（FTA）是从中药连翘中分离得到的主要生物活性成分，长期以来在中国被用于治疗各种炎症性疾病。FTA具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗病毒、抗氧化应激和神经保护作用。目前，尽管关于FTA是否对CNP发挥治疗作用的报道很少，但越来越多研究表明，FTA能在几种炎症性疾病中抑制核因子κB（NF-κB）通路。根据Swisstargetprediction分析，蛋白激酶Cα（PKCα）被预测为FTA最可能的靶点。PKCα是PKC家族的成员，作为细胞信号转导子参与炎症调节。据报道，PKCα能激活包括NF-κB通路在内的多种信号通路，并在多种细胞生理过程中发挥关键作用。
本研究旨在探讨FTA对完全弗氏佐剂（CFA）诱导的CNP动物模型的潜在治疗作用，并研究FTA是否通过PKCα/NF-κB通路调节自噬来减轻CNP。
方法
动物与伦理声明
将六周龄Sprague-Dawley大鼠（雄性，240–260克）饲养在无特定病原体实验室（12/12小时光暗周期），自由获取食物和饮用水。本研究涉及动物的所有实验程序均经浙江百岳生物技术有限公司实验动物福利机构动物护理和使用委员会批准（编号ZJBYLA-IACUC-20221202），并依据中国动物护理和使用委员会指南进行。
药物制备
FTA（C29H36O15，纯度≥99%，HY-N0028）和G? 6983（特异性蛋白激酶C（PKC）抑制剂；纯度：99.32%，HY-13689）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯章克申）。使用10%二甲基亚砜（20-139，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）溶解FTA和G? 6983制备储备液。氯喹（CQ，自噬通路抑制剂；60 mg/kg）同样购自Sigma-Aldrich，并用无菌盐水稀释。
动物实验与给药
采用前列腺内注射CFA（YZ-642852，Acmec Biochemical Co., Ltd，中国上海）的方法构建CNP大鼠模型，方法如前所述。简言之，将大鼠随机分为八组：正常组、模型组、模型+FTA-L组、模型+FTA-H组、模型+CQ组、模型+FTA-H+CQ组、模型+G? 6983组和模型+G? 6983+FTA-H组。后三组大鼠在使用3%异氟烷（792632，Sigma-Aldrich，美国）于麻醉系统（RWD Life Science，中国深圳）中麻醉后，经下腹部切口暴露膀胱下方的前列腺腹叶。随后，将100 μL CFA注射到暴露的前列腺中，然后缝合伤口。同时，正常组大鼠接受假手术，不注射CFA。接下来，模型+FTA-L组和模型+FTA-H组大鼠分别于术后第二天开始，通过口服灌胃给予40 mg/kg和80 mg/kg玉米油稀释的FTA。同时，模型+CQ组和模型+FTA-H+CQ组大鼠接受CQ腹腔注射，而模型+G? 6983组和模型+G? 6983+FTA-H组大鼠通过相同途径给予G? 6983（10 μg/kg）。模型+FTA-H+CQ组和模型+G? 6983+FTA-H组同时灌胃高剂量FTA（80 mg/kg）。FTA给药连续进行4周。模型组大鼠以相同方式给予等体积玉米油（载体）。之后，对所有大鼠称重，并在麻醉（45 mg/kg戊巴比妥钠，P-010，Sigma-Aldrich，美国）下处死。
前列腺指数计算
从处死的大鼠身上取出前列腺样本并称重，用于计算前列腺指数，公式如下：前列腺指数 = 前列腺重量 / 体重 × 10000。之后，将大鼠前列腺保存在液氮中备用。
组织学分析
用4%多聚甲醛（PFD；abs9179，Absin，中国上海）固定大鼠前列腺，然后脱水。随后，将石蜡包埋的样本切成5微米厚的切片。脱蜡复水后，切片在室温下依次用苏木精（abs9214，Absin，中国）和伊红（AG1100，Acmec Biochemical Co., Ltd，中国）染色。使用光学显微镜（Eclipse 80i，Nikon，日本东京）在40倍放大倍数下观察五个随机视野的前列腺形态。根据指南使用炎症评分（0-4）量表评估前列腺损伤程度。
免疫组织化学（IHC）染色
为检测CNP建模后大鼠前列腺中CD3+T细胞和CD45+白细胞的存在，用柠檬酸（AC10801，Acmec Biochemical Co., Ltd，中国）处理前列腺切片进行抗原修复。之后，将切片暴露于3%过氧化氢（H299581，Aladdin，中国上海），用磷酸盐缓冲盐水（PBS；C0221A，Beyotime，中国上海）洗涤，并在室温下用山羊血清（abs933，Absin，中国）封闭。然后，使用CD3抗体（14-0030-82，Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和CD45抗体（MA1-70000，Thermo Fisher，美国）在4°C下孵育切片过夜。在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（31430，Thermo Fisher，美国）杂交1小时。用3,3′-二氨基联苯胺（AC11043，Acmec Biochemical Co., Ltd，中国）显色并用苏木精复染后，通过光学显微镜（40倍放大）检测免疫反应性。
酶联免疫吸附测定（ELISA）
为测量CNP大鼠前列腺中炎症相关细胞因子的水平，包括白细胞介素1β（IL-1β）、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-17A和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），使用来自Novus Biologicals（美国科罗拉多州利特尔顿）的商业大鼠ELISA试剂盒（RLB00/R2000/R6000B/RTA00）以及来自Sangon Biotech（中国上海）的商业大鼠ELISA试剂盒（D731078/D731095）进行ELISA。简要步骤如下：将新鲜前列腺组织在预冷的补充了蛋白酶抑制剂（G2008，Servicebio，中国武汉）的PBS中匀浆，并在5,000 × g下离心10分钟以获得上清液。接下来，将100 μL稀释样品在37°C下培养于预包被的ELISA板的每个孔中90分钟，并与100 μL生物素化检测抗体培养1小时。洗涤后，在37°C下与HRP偶联稀释液孵育30分钟，随后在无光条件下用底物试剂进行显色处理。使用酶标仪（Infinite 200，Tecan，瑞士曼内多夫）在450 nm波长下测量每个孔的吸光度。
蛋白质印迹（Western Blot）
用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（P1045，Beyotime，中国）的RIPA裂解缓冲液（89901，Thermo Fisher，美国）制备前列腺匀浆。使用BCA蛋白测定试剂盒（71285-3，Sigma-Aldrich，美国）定量收集的上清液中的蛋白质浓度。蛋白质提取物经变性后通过10% SDS-PAGE进行分离。将等量的凝胶上蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜（G6015，Servicebio，中国）上，并在室温下用5%牛血清白蛋白（A1933，Sigma-Aldrich，美国）封闭1小时。接下来，将膜与针对Beclin-1（ab207612，52 kDa，Abcam，英国剑桥）、LC3B（ab192890，16/14 kDa，Abcam，英国）、蛋白激酶Cα（PKCα；ab32376，75 kDa，Abcam，英国）、p-p65（ab76302，65 kDa，Abcam，英国）、p65（#8242，65 kDa，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯）以及内参GAPDH（ab181602，36 kDa，Abcam，英国）的一抗在4°C下孵育过夜。第二天，在室温下用HRP偶联的小鼠抗兔IgG（D110065，Sangon Biotech，中国）探测膜2小时。使用增强化学发光底物（32106，Thermo Fisher，美国）显示免疫印迹。使用Image Quant LAS 4000系统（GE Healthcare，美国马萨诸塞州马尔伯勒）对蛋白质信号进行光密度分析。
统计分析
本研究中的数据表示为至少三次独立实验的平均值±平均标准误。使用Graphpad Prism 8.0（GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行所有统计分析。多组间比较采用单因素方差分析。P值小于0.05认为具有统计学显著性。
结果
FTA处理降低了CNP大鼠模型的前列腺指数
为研究FTA对CNP的影响，首先建立了CFA诱导的CNP大鼠模型。正常组和模型组之间的体重几乎没有变化。经过4周的FTA给药后，40 mg/kg或80 mg/kg的FTA对CNP大鼠模型的体重没有显著影响。CNP建模后，大鼠的前列腺指数升高，而在40 mg/kg或80 mg/kg FTA治疗后，该指数显著降低。
FTA处理减轻了CNP大鼠模型的前列腺损伤和炎症浸润
与正常大鼠相比，在CNP大鼠模型的前列腺中观察到显著的炎症浸润、水肿和粗糙的腺泡形状，这些变化在40 mg/kg或80 mg/kg FTA治疗后得到缓解。炎症评分在CNP建模后的大鼠中显著增加，但在模型+FTA-L和模型+FTA-H组中降低。接下来，应用IHC测定法量化前列腺组织中CD3和CD45的表达以分析淋巴细胞浸润。结果显示，CNP大鼠模型中CD3阳性细胞和CD45阳性细胞的数量增加。不同浓度（40 mg/kg和80 mg/kg）的FTA处理降低了CNP大鼠模型中CD3阳性细胞和CD45阳性细胞的数量。
FTA处理抑制了CNP大鼠模型前列腺组织中炎症相关细胞因子的释放
使用ELISA评估了大鼠前列腺组织中炎症相关细胞因子的释放。结果表明，与正常组相比，模型组中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17A、MCP-1和TNF-α的表达水平显著更高。值得注意的是，使用40 mg/kg或80 mg/kg剂量的FTA治疗降低了CNP大鼠模型前列腺组织中这些细胞因子的表达。
FTA处理促进了CNP大鼠模型前列腺组织中的自噬并阻断了PKCα/NF-κB通路
自噬在调节细胞间炎症反应中起关键作用。随后使用Western Blot检测了大鼠前列腺组织中的自噬标志物Beclin-1和LC3B，结果显示CNP建模下调了Beclin-1和LC3B II/LC3B I，但在FTA（80 mg/kg）治疗后，CNP大鼠前列腺组织中的表达增加。CQ抑制了Beclin-1和LC3B II/LC3B I的表达，而FTA抵消了这种抑制。ELISA结果表明CQ促进了炎症，但FTA减弱了其效应。G? 6983进一步阻断了PKCα/NF-κB信号通路。ELISA结果显示FTA降低了大鼠前列腺组织中的炎症因子，而G? 6983进一步抑制了炎症。
讨论
本研究首次证实FTA通过降低前列腺指数、减轻前列腺损伤和减少炎症反应，对大鼠CNP表现出治疗作用。进一步，本研究证明FTA促进了CNP大鼠来源前列腺组织中自噬的激活并抑制了PKCα/NF-κB通路。
CNP的特征是泌尿生殖系统症状，如尿急、尿频、疼痛和性功能障碍，且无尿路感染或其他可识别的致病因素。现有证据已证实针对前列腺抗原的自身免疫引起的炎症失调是CNP的诱因之一。因此，前列腺内注射CFA的动物，由于T细胞激活导致前列腺腺体炎症和免疫细胞浸润，常被用作CNP研究中自身免疫性前列腺炎的实验模型。本研究中，注射CFA的大鼠表现出显著的前列腺组织损伤、炎症反应以及CD3+T细胞和CD45+白细胞数量增加，这与Yang等人的发现一致。然而，这些变化在FTA给药后被逆转。作为一种活性化合物，关于FTA对慢性前列腺炎抗炎作用的研究很少。有趣的是，最近的证据表明，连翘酯苷B可以通过减少促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）来显著抑制炎症，从而减轻CFA诱导的小鼠慢性炎症性疼痛。在卵清蛋白诱导的哮喘中，已发现FTA可减轻小鼠的气道炎症。此外，FTA可以降低大鼠血清中促炎细胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）的水平，以减轻阿霉素诱导的肾病中的肾损伤。在CNP患者中，免疫炎症细胞分泌的促炎细胞因子，包括IL-1β、IL-2、IL-6、MCP-1和TNF-α，在精浆、前列腺分泌物和尿液中上调。据我们所知，MCP-1在CNP发展过程中通过招募T细胞、单核细胞和巨噬细胞发挥关键介质作用。由Th17细胞产生的IL-17A在CNP大鼠模型中增加，并且IL-17A的上调与自身免疫和炎症反应相关。根据ELISA结果，我们发现CNP大鼠模型前列腺组织中IL-1β、IL-2、IL-6、MCP-1、TNF-α和IL-17A的水平升高，但这些趋势被FTA处理逆转。总之，FTA有潜力作为治疗CNP的抗炎剂。
随后，本研究进一步探讨了FTA对CNP的潜在分子机制。有趣的是，FTA在许多炎症性疾病中的抗炎活性与NF-κB通路的调节相关。NF-κB是一种关键的转录因子，可通过多种途径被激活，以介导参与炎症、凋亡或自噬的关键基因的转录。前列腺炎中NF-κB的激活已被证明与慢性炎症和疾病严重程度相关。最近有报道称，前列欣胶囊通过抑制NLRP3炎症小体来抑制NF-κB，从而改善17β-雌二醇诱导的CNP。作为一种胞质多蛋白复合物，NLRP3炎症小体在自噬过程中发挥调节作用，以平衡宿主防御性炎症并防止过度炎症。Lang等人发现FTA可以抑制NLRP3炎症小体的激活，从而减轻甲氨蝶呤诱导的大鼠肠道粘膜炎。在本研究中，Western Blot结果显示CNP大鼠模型前列腺组织中Beclin-1和LC3B II/LC3B I的表达降低，证实了CNP中自噬受到抑制。众所周知，p65的激活是NF-κB信号通路中的核心事件。在前列腺组织中，我们发现CNP建模诱导的Beclin-1和LC3B II/LC3B I下调以及p65磷酸化上调在FTA处理后发生逆转。作为FTA的一个推定靶点，PKCα已被报道在炎症中发挥调节作用，但其对慢性前列腺炎的影响尚不清楚。Chen等人提出，PKCα抑制可通过阻断NF-κB通路来保护小鼠肺部免受脓毒症诱导的过度炎症反应和氧化应激。PKCα也可以通过p65核转位刺激NF-κB通路的激活来调节凋亡抵抗，从而促进尿路上皮癌。在本研究中，我们观察到PKCα的表达在CNP大鼠模型的前列腺组织中增加，而FTA逆转了这一现象。上述发现暗示FTA对CNP大鼠模型中NF-κB激活的抑制作用可能是通过靶向PKCα介导的。值得注意的是，本研究存在一些局限性，例如未通过免疫荧光显微镜提供核转位的直接视觉证据。未来的研究可以结合免疫荧光技术，以更清晰地阐明这一关键细胞过程的空间和时间分辨率。
总之，本研究提供了新的证据，表明FTA通过阻断PKCα/NF-κB通路，减轻CNP大鼠模型的炎症并促进自噬。基于我们目前的发现，我们认为FTA有希望成为CNP的潜在治疗剂。
