《Frontiers in Nutrition》：Evaluation of flavonoid composition and biological activities of hydrolyzed whole pomelo juice
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本研究通过酶解技术制备全柚汁（WPJ），系统评价了其黄酮组成、体外抗氧化活性及体内外抗炎、镇咳、祛痰作用。结果表明WPJ富含多种黄酮（如橙皮苷、柚皮苷等），能够剂量依赖性地抑制LPS（脂多糖）诱导的RAW264.7巨噬细胞产生一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子；在苯酚红诱导的小鼠模型中，WPJ可促进呼吸道酚红分泌、抑制咳嗽反应，并部分通过抑制MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）/NF-κB（核因子κB）信号通路活化减轻肺部炎症。研究证实WPJ作为一种功能性饮品，在缓解咳嗽、痰多相关呼吸道疾病方面具有应用潜力。
1 引言
功能性饮料因富含维生素、矿物质、抗氧化剂等生物活性物质而备受关注。柚作为芸香科柑橘属水果，富含黄酮、膳食纤维、果胶等成分，其黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种药理活性。传统加工方式造成大量果皮、果肉等副产物浪费，利用全果制备果汁可提高资源利用率。酶解技术能有效破坏细胞壁结构，释放更多营养成分与活性物质。咳嗽是机体清除呼吸道分泌物的防御反射，现有镇咳药物多伴有副作用，因此从天然产物中寻找有效镇咳祛痰成分成为研究热点。民间常用柚缓解咳嗽，但全柚镇咳祛痰作用及其机制尚不明确。本研究通过酶解制备全柚汁（WPJ），系统分析其营养成分、黄酮组成，并评价其体外抗氧化、抗炎活性及体内镇咳祛痰效果，探讨其作用机制。
2 材料与方法
2.1 材料与试剂
柚果实购自广东梅州振宝有限公司。RAW 264.7细胞购自中国科学院典型培养物保藏中心。脂多糖（LPS）、Griess试剂等购自Sigma-Aldrich。小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10检测ELISA（酶联免疫吸附测定）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Kechuanning丸（OTC，非处方药）购自江西仁和药业。
2.2 全柚汁制备
新鲜柚经清洗后，将果皮与果肉分别破碎打浆，加入果胶酶和蛋白酶（0.3 g/100 g）在50–55°C酶解70–110分钟。酶解后脱气、均质，135°C灭菌6秒，得WPJ。
2.3 保质期评估
将WPJ于20–22°C储存，分别测定储存1、3、5年后的总黄酮和柚皮苷含量，以确定最佳活性物质保存期。
2.4 WPJ营养成分分析
采用福林酚法测定总多酚，硝酸铝比色法测定总黄酮，高效液相色谱法（HPLC）测定柚皮苷及维生素B1、B2、B6、C、E含量，电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定钙、铁、钾、镁、磷、锌等矿物质。
2.5 WPJ黄酮结构分析
2.5.1 LC-MS测定
采用60%乙醇溶液超声-微波协同提取WPJ中粗黄酮，经真空浓缩冷冻干燥后，利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行非靶向代谢物分析。色谱柱为ACQUITY UPLC? BEH C18柱（2.1 × 100 mm, 1.7 μm），流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱。质谱采用电喷雾离子源（ESI），正负离子模式采集。
2.5.2 黄酮抗氧化性能测定
选取含量最高的10种黄酮（橙皮苷、蒺藜苷、黄芩苷、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、橙皮素、新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮素、柚皮苷、棕矢车菊素、松属素）评估其DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基清除能力及AAPH（2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐）诱导红细胞溶血保护作用。
2.6 细胞毒性、抗炎及抗氧化活性评价
2.6.1 细胞培养
小鼠巨噬细胞RAW 264.7于37°C、5% CO2条件下，采用含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和青霉素的DMEM（杜氏改良 Eagle 培养基）培养。
2.6.2 细胞活力、一氧化氮及促炎细胞因子测定
采用MTT法检测细胞活力。实验分为空白对照组（CK，无LPS）、模型组（1 μg/mL LPS刺激）、WPJ处理组（25%、50%、75%、95% WPJ预处理2小时后加LPS）及阳性药Kechuanning（KCN）组。收集细胞上清，Griess法测NO，ELISA法测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。
2.7 动物实验与给药
雄性BALB/c-nu裸鼠（4周龄）适应性饲养1周后随机分为6组（每组10只）：CK组（生理盐水）、模型组（蒸馏水+NH4OH诱导）、25% WPJ组（低剂量）、50% WPJ组（中剂量）、75% WPJ组（高剂量）、KCN组（阳性对照）。灌胃给药（15 mL/kg）1小时后，将小鼠置于玻璃容器中吸入0.3 mL 25% NH4OH蒸气45秒，记录6分钟内咳嗽次数。另通过腹腔注射酚红溶液评估祛痰效果。
2.8 镇咳祛痰实验
腹腔注射2.5%酚红溶液30分钟后处死小鼠，取气管置于1 mL生理盐水中冲洗，加0.1 mL 1 M NaOH后于548 nm测吸光度，计算酚红分泌增加百分比。镇咳活性以咳嗽抑制率表示。
2.9 组织病理学分析
肝组织经10%福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋后，切片3 μm，苏木精-伊红（HE）染色，于200倍显微镜下观察并拍照。
2.10 炎症细胞含量
全血经EDTA-K2抗凝，采用全自动血细胞分析仪检测白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞数量。
2.11 炎症因子测定
肺泡灌洗液离心取上清，ELISA法测NO、IL-4、IL-6、IL-10水平。右肺中叶制备10%组织匀浆，离心取上清测TNF-α浓度。
2.12 Western blotting
提取肝组织总蛋白，Western blotting检测MAPK p38、NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平。
2.13 数据处理与分析
数据以均值±标准差表示，采用SPSS v19.0进行单因素方差分析，Origin 2018制图。
3 结果与讨论
3.1 最佳储存期确定
随储存时间延长，WPJ中总黄酮及柚皮苷含量显著下降（p< 0.05）。储存1年时总黄酮含量为950.68 mg/100 g，2年后降至640.42 mg/100 g，5年后为600.19 mg/100 g；柚皮苷由23.08 mg/L降至10.65 mg/L。考虑到活性成分保留，选择储存1年的WPJ进行后续实验。
3.2 WPJ营养成分
储存1年的WPJ总黄酮含量为950.68 ± 7.65 mg/100 g，富含矿物质（钙121.12 ± 0.57 mg/L，钾579.20 ± 0.16 mg/L）及维生素C（104.90 ± 0.28 mg/100 g）、烟酸（230.53 ± 4.51 μg/100 g）等。
3.3 WPJ黄酮结构表征
LC-MS共鉴定出679种物质，其中31种为生物活性黄酮，包括橙皮苷、蒺藜苷、黄芩苷、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、橙皮素、新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮素、柚皮苷、棕矢车菊素、松属素等。抗氧化实验显示，柚皮素、黄芩苷、橙皮苷、新橙皮苷二氢查耳酮对ABTS自由基清除IC50分别为184.63 ± 12.32 μg/mL、234.27 ± 21.36 μg/mL、240.21 ± 16.87 μg/mL、263.44 ± 19.58 μg/mL；对DPPH自由基清除IC50依次为新橙皮苷二氢查耳酮（468.76 ± 36.76 μg/mL）、橙皮苷（697.36 ± 57.23 μg/mL）、黄芩苷（774.86 ± 58.94 μg/mL）、柚皮素（863.33 ± 48.97 μg/mL）。AAP
