BnaGRP3通过调控Na+/K+稳态及与BnaPIPs互作介导甘蓝型油菜耐盐性的分子机制

《Journal of Advanced Research》：BnaGRP3 mediates salt tolerance via Na+/K+ homeostasis and BnaPIPs interactions in Brassica napus

本研究针对甘蓝型油菜耐盐分子机制不清的问题，通过分子遗传学、转录组学和蛋白互作分析，揭示了BnaGRP3通过维持Na+/K+稳态并与BnaPIPs互作调控H2O2平衡，从而增强盐胁迫耐受性。该研究为作物抗逆育种提供了新靶点，发表于《Journal of Advanced Research》。

　　

随着全球耕地盐渍化加剧，作物安全生产面临严峻挑战。土壤盐分通过引发离子毒性和氧化损伤，破坏植物细胞稳态，导致减产甚至绝收。甘蓝型油菜作为重要油料作物，兼具经济价值与生态修复潜力，但其耐盐分子机制尚未完全阐明。以往研究多聚焦于离子转运蛋白（如SOS通路）或活性氧（ROS）清除系统，而对连接离子稳态与氧化平衡的桥梁蛋白关注不足。

本研究聚焦于甘蓝型油菜中的甘氨酸富集蛋白3（BnaGRP3），发现其在盐胁迫下显著诱导表达。通过CRISPR/Cas9技术构建三突变体bnagrp3，发现其盐敏感性显著增强，表现为生物量下降、Na⁺/K⁺比率失衡及H₂O₂积累。转录组分析揭示，BnaGRP3通过调控NHX1、SKOR等离子转运基因表达维持离子稳态。免疫沉淀-质谱（IP-MS）和酵母双杂交（Y2H）实验证实BnaGRP3与4个质膜内在蛋白（BnaPIPs）互作，后者通过形成同/异源复合体促进H₂O₂外排，缓解氧化损伤。在拟南芥中过表达BnaPIPs可增强盐耐受性，验证其功能保守性。该研究首次揭示BnaGRP3-BnaPIP模块通过协同调控离子稳态与ROS信号传递耐盐性的新机制，为作物抗逆遗传改良提供了理论依据。

研究采用分子遗传学（CRISPR/Cas9突变体、过表达株系）、转录组测序（RNA-seq）、蛋白互作分析（Y2H、双分子荧光互补BiFC、荧光素酶互补LCA）、生理指标检测（离子含量、H₂O₂、丙二醛MDA、脯氨酸）及酵母功能互补实验。实验材料包括甘蓝型油菜栽培种Westar的转基因株系及拟南芥哥伦比亚生态型。

BnaGRP3正向调控盐耐受性

盐胁迫下BnaGRP3表达显著上调。三突变体bnagrp3在盐处理下地上部鲜重和干重分别降低23.95%-24.71%和23.81%-28.57%，H₂O₂、MDA和脯氨酸含量显著升高。过表达BnaGRP3的拟南芥在120 mM NaCl条件下根长和鲜重增加41.01%-79.85%，氧化损伤指标下降，证实BnaGRP3是盐胁迫正调控因子。

BnaGRP3同源基因功能冗余

BnaA7.GRP3与BnaC7.GRP3具有相似表达模式与膜定位特性。单/双突变体未表现明显表型，而三突变体盐敏感性显著，表明同源基因功能冗余，共同应对盐胁迫。

bnagrp3转录组分析

RNA-seq发现突变体中活性氧代谢与ABA信号通路基因富集。盐胁迫下突变体Na⁺转运相关基因（如NHD1、CIPK16）上调，K⁺通道基因（如TPK2、SKOR）表达紊乱，导致Na⁺积累和K⁺流失，Na⁺/K⁺比率较野生型提高1.29-2.2倍。

BnaGRP3与BnaPIPs互作

IP-MS筛选出606个互作蛋白，包括4个BnaPIPs（BnaA3.PIP2-2、BnaC3.PIP2-6等）。Y2H、BiFC和LCA验证BnaGRP3与BnaPIPs在膜上形成复合体。

BnaPIPs通过H₂O₂外排增强耐盐性

过表达BnaPIPs的拟南芥盐胁迫下氧化损伤减轻。酵母实验表明BnaPIPs可介导H₂O₂外排，提升细胞耐受性。BnaPIPs间形成同/异源聚合体，可能增强通道活性。

讨论与结论

研究提出创新模型：盐胁迫下BnaGRP3通过调控离子转运基因转录维持Na⁺/K⁺稳态，同时与BnaPIPs互作促进H₂O₂外排。H₂O₂作为信号分子链接离子稳态与氧化平衡，其中SKOR可能受H₂O₂激活反馈调节K⁺flux。该研究揭示了GRP蛋白在非生物胁迫中超越RNA结合功能的新角色，为多倍体作物抗逆机制提供了新视角。