《Plant Biotechnology Journal》：Tomato Spotted Wilt Virus Reprogrammes Host Glycolysis to Facilitate Proliferation by a Phase-Separated Co-Aggregate of Nucleocapsid Protein and Phosphoglycerate Kinase
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本研究揭示了番茄斑萎病毒(TSWV)核衣壳蛋白(N)通过相分离(PS)招募宿主磷酸甘油酸激酶(NbPGK)形成生物分子凝聚体(BMCs)，重构宿主糖酵解通路产生ATP，不仅为病毒核糖核蛋白(RNP)复制供能，还以非酶方式调控PS网络促进病毒增殖。团队开发的小分子PS调节剂F10可特异性靶向N蛋白关键位点(Arg94/Lys192/Gly228)，有效解离N-NbPGK复合物并释放被劫持的宿主因子，其抗病毒活性优于商品化药剂宁南霉素，为靶向病毒相分离过程的抗病毒策略提供了新范式。
2 结果
2.1 TSWV N与宿主蛋白磷酸甘油酸激酶的相互作用
基于已有Co-IP MS数据，研究发现本氏烟中瞬时表达Flag-TSWV N可显著上调NbPGK表达。通过荧光素酶互补(LCA)和双分子荧光互补(BiFC)验证了TSWV NWT与NbPGK的相互作用，其相互作用诱导形成具有凝胶特性的包涵体(IBs)，且该现象具有病毒特异性。体外实验证实sfGFP-NWT与sfGFP-NbPGK在PEG8000诱导下可形成动态凝聚体，生物层干涉(BLI)进一步量化了二者结合亲和力。
2.2 NbPGK沉默削弱TSWV感染
利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术，发现沉默NbPGK可显著减轻TSWV系统感染症状，降低病毒N蛋白积累及转录水平约60%-70%。而过表达mCherry-NbPGK虽不独立形成凝聚体，但与NWT-YFP共表达时可促进颗粒增大并部分共定位，表明NbPGK被招募至N蛋白颗粒中协同促进相分离。
2.3 NbPGK-N相互作用重构宿主糖酵解通路
转录组分析显示N蛋白通过调控糖酵解关键酶（NbHK、NbALDO、NbPGK、NbPK上调，NbGAPDH下调）重构代谢通路。糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)处理可剂量依赖性地抑制N蛋白凝聚体形成，并降低ATP水平，证明糖酵解通量对相分离的调控作用。
2.4 糖酵解来源的ATP促进N蛋白相分离
外源ATP在低浓度(0.1-0.25 mM)时可促进N蛋白凝聚体形成，且具时间依赖性。粗粒化分子动力学(CGMD)模拟表明ATP通过桥接作用在低浓度促进相分离，高浓度则抑制。体外实验证实1-2 mM ATP可增强sfGFP-NWT/sfGFP-NbPGK凝聚体形成，MST和BLI检测到ATP与N蛋白直接结合(KD分别为1.49 μM和0.48 μM)。
2.5 小分子F10通过靶向N蛋白显著抑制凝聚体形成
基于喹啉衍生物设计的相分离调节剂F10可有效减少N蛋白包涵体数量。在TSWV微型基因组复制系统(L(+)opt+SR(+)eGFP+VSRs)中，F10处理显著抑制RNP复制及N蛋白积累。半叶法试验显示F10的EC50为81.83 μg/mL，优于宁南霉素(136.29 μg/mL)，且对番茄宿主无药害。
2.6 F10与N蛋白关键结合位点缺失显著抑制病毒增殖
分子对接显示F10与N蛋白Arg94、Lys192、Gly228形成氢键，分子动力学模拟结合自由能为-38.07 kcal/mol。三重突变体(R94A&K192A&G228A)在RNP复制系统中荧光信号显著减弱，系统感染发病率降至10%，且F10与突变体结合亲和力显著降低(BLI检测KD从8.75 μM升至350 μM)。
2.7 结合位点突变显著抑制凝聚体形成
NR94A&K192A&G228A-YFP在本氏烟细胞中无法形成可见凝聚体，但其与NbPGK的相互作用仍保留。F10处理可破坏NWT及突变体与NbPGK的相互作用，表明F10通过解离N-NbPGK复合物释放宿主因子。
3 讨论
研究阐明了TSWV通过相分离机制劫持宿主糖酵解通路的新范式：病毒N蛋白招募NbPGK形成凝聚体，局部产生的ATP既为病毒复制供能，又作为相分离调节剂促进凝聚体成熟。F10通过靶向N蛋白关键位点破坏该过程，为开发靶向病毒-宿主互作的抗病毒策略提供了新思路。
4 材料与方法
实验涵盖Co-IP MS筛选、LCA/BiFC验证、VIGS沉默、体外相分离重建、MST/BLI结合检测、分子对接与动力学模拟、微型基因组复制系统评估及化合物活性测定等技术体系。所有突变体通过同源重组构建，活性评价采用半叶法及表型观察。
