《Plant Biotechnology Journal》：Serial Spatial Transcriptomes Reveal Regulatory Transitions in Maize Leaf Development
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本综述系统总结了利用10× Genomics Visium系统优化的空间转录组技术，在玉米幼苗茎尖分生组织（SAM）及连续发育叶片中重建三维基因表达谱的研究。文章通过空间-时间转录组分析，识别了参与分生组织维持、叶原基起始、维管组织分化和细胞异质性的关键调控基因，并开发了从切片制备到数据处理的完整实验流程。该研究为解析植物发育转换、细胞类型特化和分化的分子事件提供了重要技术平台和理论基础。
优化玉米幼苗茎尖切片构建空间转录组的技术流程
研究团队针对植物组织特点对10× Genomics Visium空间基因表达系统进行了技术优化。通过比较"先新鲜冷冻"和"先OCT浸泡"两种冷冻保存方法，发现两种方法均能良好保持RNA完整性（RIN值分别为9.2和9.4）。实验证明甲基丁烷、甲醇、异丙醇、室温孵育、染色染料、蛋白酶K或胃蛋白酶介导的透化处理等关键步骤对RNA质量无显著影响，但胃蛋白酶在0.1N HCl中的孵育时间对RNA完整性具有时间依赖性影响。
特别值得关注的是，研究团队开发了"两步OCT包埋"技术，通过先将组织样品浸泡在稀释的OCT中防止气泡形成，精确定向后用最小量OCT进行冷冻固定，有效减少了细胞内冰晶形成。这种改良方法特别适用于复杂脆弱的SAM结构，确保了切片组织的完整性和mRNA捕获效率。
获取发育中玉米叶片的连续空间转录组
在实验设计上，研究团队选择了玉米茎尖的横切面作为研究对象，因为植物结构如SAM和叶原基在横切面视图中更容易区分。通过对72小时吸胀后的玉米幼苗进行解剖，每个生物学重复获得3-4个从SAM顶端到其下方约108μm的连续横切面，共获得14个生物学重复的54个切片数据。
技术流程包括冷冻切片、VT Slide显微成像、测序文库构建和Illumina短读长测序。每个6.5×6.5mm捕获区域可容纳单个幼苗的3-4个茎尖横切面，组织覆盖斑点比例从18.86%到40.52%不等。测序数据显示，每个斑点的平均读数范围从79828到155375，每个斑点检测到的基因中位数从4623到8416，数据质量与哺乳动物组织数据集相当。
空间转录组方法的高可靠性验证
通过整合14个数据集并进行归一化处理，研究发现组织斑点根据结构域紧密聚集，可分为三个明显组别：SAM和发育叶片、胚芽鞘以及胚芽鞘内维管组织。已知标记基因的表达模式验证了该方法的可靠性，如Knotted-1（KN1）和NAC转录因子119（NAC119）主要在SAM斑点中表达，而Auxin Import Carrier 4（AIC4）和DNA-binding with one finger transcription factor 11（DOF11）在胚芽鞘维管中显示主要或相对高表达。
与90个通过探针原位测序（ISS）检测的基因比较显示，69个基因在两种方法中呈现高度匹配的表达模式。此外，研究人员通过垫锁探针原位杂交验证了AIL6、ANT1、ANT3和TML1等基因的表达模式，结果与空间转录组谱基本一致。
玉米发育茎尖的基因表达谱特征
伪批量基因表达谱的主成分分析（PCA）显示四个主要组别：SAM、发育叶片、胚芽鞘和胚芽鞘维管。层次聚类分析表明，胚芽鞘阶段的基因表达谱最为独特，与其他发育阶段差异显著。通过基因表达趋势的层次聚类，研究人员识别了7个主要基因簇，反映了从未分化的SAM到各分化阶段叶片的发育轨迹。
基因本体（GO）富集分析揭示了三个主要生物学主题：簇1富含核心生物合成、基因表达和细胞组织相关术语，反映了分生组织域的快速细胞循环；簇6以共价染色质和组蛋白修饰为特征，表明细胞退出分生组织并承诺分化时的表观遗传重塑；簇7显示防御、次级代谢和创伤反应特征，表明这些幼年保护组织中存在预期防御程序。
发育中玉米茎尖细胞类型的鉴定与表征
通过无监督聚类，研究团队在玉米茎尖中识别出33个不同的簇，基于空间定位和独特基因表达模式将其分类为12个主要超群。与发育叶片相关的簇被分类为"SAM_P4"、"leaf_meso"和"leaf_vein"，分别代表从茎尖分生组织到P3-P4发育阶段的细胞、P4和P5中的非维管叶肉和表皮细胞以及相同发育阶段内的维管组织。
值得注意的是，胚芽鞘表现出显著的转录异质性，特别是在基本组织中。虽然该区域组织学上由形态统一的薄壁细胞组成，但转录组分析揭示了不同的分子域。研究团队鉴定了"co_meso_polar"、"co_meso_ad"、"co_meso_nearvein"等分子域，以及代表向轴和背轴维管域的"co_vein_ad"和"co_vein_ab"。
连续发育叶片中的基因表达顺序
研究发现，在"SAM和发育叶片"组中，结构域的组织顺序为SAM、P1_P2、P3、P4和P5，忠实地反映了组织分化的顺序和复杂程度。通过RNA速度和伪时间分析，研究人员证实了观察到的基因表达转换反映了玉米叶片的形态发育。尽管只有7%的总UMI读数是新生转录本，但RNA速度估计仍显著预测了从SAM到P5的核心发育轨迹。
早期叶片发育的时间顺序基因共表达网络
通过时间顺序基因共表达网络（TO-GCN）分析，研究团队在空间转录组中识别了1265个转录因子（TF）基因，根据基因共表达（皮尔逊相关系数PCC>0.95）将其组织成13个层次水平。基因富集分析显示特定模式：SAM在L1到L4水平有TF富集峰值；早期叶原基（P1-P2）在L5和L6；中期叶片发育（P3）在L7；更高级叶片发育（P4）在L9；相对成熟叶片阶段（P5）在L9和L10。
单细胞参考与空间图谱的整合
研究人员将已发表的玉米单细胞RNA测序数据集与空间转录组进行比较，发现26925个基因的伪批量表达谱具有强一致性（Spearman's ρ=0.80）。通过Harmony校正有效去除了批次特异性效应，单细胞RNA测序UMAP解析为对应于精细细胞身份的紧凑、批次混合的岛屿。相比之下，Visium UMAP将这种组织和细胞类型异质性表示为一个连续的双叶流形，通过一个桥梁连接，对应于从SAM→P1/P2→P3→P4→P5的发育轴。
候选TF调控因子指定茎尖分生组织和叶原基起始
为鉴定参与SAM发育或叶原基分化的候选TF，研究人员比较了五个结构域之间的差异基因表达分析结果和TO-GCN的L1和L2水平中鉴定的TF，发现了30个共同基因。这些基因包括Delayed Flowering 1（DLF1）转录因子，其在空间转录组数据中的表达水平从SAM到P3非常高，但在P4显著降低。
通过三维重建技术，研究人员展示了基因表达沿茎尖远端-近端轴的连贯模式。例如，NAC119和HB46在单个幼苗（VR03）的四个连续切片和合并这些切片的三维重建中显示一致模式，证明了如何沿远端-近端轴检查表达。
SAM或叶片发育中候选基因的功能特征
研究团队重点关注了15个在玉米茎尖分生组织和早期叶原基中表达的玉米GRF转录因子。基于系统发育树中的两个主要分支，这些ZmGRFs的表达模式被组织起来。为进行功能验证，优先选择ZmGRF6作为SAM富集的DEG；ZmGRF8通过层次聚类位于最早表达程序中；ZmGRF10在P4-P5显示远端峰值，将覆盖范围扩展到后期早期叶片发育。
通过CRISPR/Cas9介导的诱变，研究人员在Setaria viridis中创建了这三个基因的orthologs突变体。这些突变导致移码，引入提前终止密码子，产生缺乏保守QLQ和WRC结构域的截短GRF蛋白。所有三个编辑品系均显示SAM高宽比显著降低，其中CRP-SvGRF6的影响最强。较小的SAM穹顶与降低的株高相关，表明枝条生长受限。
与ZmGRF10的远端（P4-P5偏向）表达模式一致，CRP-SvGRF10植株表现出叶长显著减少，而叶宽不变；相比之下，CRP-SvGRF6和CRP-SvGRF8在这两个性状上与野生型无显著差异。这些数据表明这三个GRFs是分生组织生长的强阳性调节因子，并将GRF10与早期叶外生长联系起来，为从空间转录组分析推断的阶段和域特异性作用提供了实验支持。
