小胶质细胞钙离子活动的时空多样性：基于非ROI分析的新发现

《GLIA》：Spatio-Temporal Diversity of Calcium Activity in Microglia

本文采用非ROI分析方法，首次在活体清醒小鼠中系统揭示了生理状态下小胶质细胞Ca2+信号的时空动态特征。研究发现，Ca2+活动主要发生于小胶质细胞突起，且倾向于局域化；当发生传播时，常呈现明确的朝向或远离胞体的方向性，而非单纯的被动扩散。研究进一步证实，Ca2+信号的传播受限于突起分支点，并揭示了P2Y12受体信号和推测的神经元活动对生理性小胶质细胞Ca2+活动的基础性调控作用，为理解小胶质细胞功能分区及其与微环境互作提供了新的视角。

　　

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的免疫细胞，但其功能远不止于此。在生理状态下，小胶质细胞呈现高度分支化的形态，其突起持续不断地延伸和回缩，对周围微环境进行动态监视，并与神经元胞体、轴突、树突和树突棘等结构直接接触。值得注意的是，小胶质细胞的各个突起似乎能够独立运作，使得单个小胶质细胞可以同时执行不同的功能。这种独立性的上游调控机制，涉及细胞内信号级联反应，而这些信号通路既受胞外刺激调节，又受到严格的亚细胞分区化控制。其中，钙离子（Ca²⁺）作为重要的第二信使，其信号活动是解码小胶质细胞功能的关键。然而，以往研究多依赖于手动绘制感兴趣区域（ROI）的分析方法，该方法对荧光信号进行区域平均，难以解析可能具有功能相关性的精细时空传播模式。

结果

2.1 采用非ROI方法对微glial Ca²⁺活动动态进行基本表征

为实现在体高分辨率成像，研究者通过交叉Iba1-tTA和tetO-GCaMP6小鼠品系，构建了Iba1-GCaMP6转基因小鼠，从而实现了GCaMP6在小胶质细胞中的特异性表达。通过对清醒小鼠进行四维（X, Y, Z, T）双光子Ca²⁺成像（持续10分钟），并利用AQuA（一种基于事件的分析平台）对成像数据进行去卷积分析，成功提取出大量具有高度多样性空间、振幅和持续时间特征的离散Ca²⁺事件。

分析发现，Ca²⁺事件的发生频率在小胶质细胞突起中显著高于胞体。根据事件发生位置（胞体 vs. 突起）和传播倾向（局域化 vs. 传播性）可对其进行有意义的分类。位于胞体的Ca²⁺事件，其局域化和传播性的比例无显著差异；而位于突起的Ca²⁺事件则显著倾向于保持局域化。

进一步对事件的时间动态分析表明，无论是胞体还是突起，传播性Ca²⁺事件的曲线下面积（AUC）均显著大于局域化事件。这种差异主要由事件持续时间的延长所驱动。在空间动态方面，传播性事件所覆盖的亚细胞区域面积也显著大于局域化事件。

2.2 基于方向性的传播性微glial Ca²⁺事件表征

类似于神经元中电活动的流动传递信息，传播性Ca²⁺事件的方向性可能蕴含着小胶质细胞整合环境信息的重要线索。研究者将传播性突起Ca²⁺事件按其传播方向倾向性分为三类：无明确方向倾向（nonDir）、朝向胞体传播（Toward）和远离胞体传播（Away）。分析显示，这三类事件在发生频率、峰值振幅、持续时间和覆盖面积上均无显著差异。同时，“Toward”和“Away”事件在平均传播速度和面积扩张速率上也未见差异。此外，所有类别Ca²⁺事件的起源频率均与距胞体的距离相关，在距离胞体10-15微米处达到峰值。

2.3 小胶质细胞Ca²⁺事件的分区化与小胶质细胞分支点相对应

与直觉（高振幅更易传播）在胞体Ca²⁺活动中成立但在突起活动中不成立的现象相反，研究者推测小胶质细胞突起的复杂形态可能对Ca²⁺信号的传播构成限制。定性观察发现，许多传播性Ca²⁺事件在遇到突起分支点时会出现“暂停-继续”（STOP-GO）的传播模式。

定量分析聚焦于传播范围最大的前20%的Ca²⁺事件。结果非常显著：所有被分析的传播性事件均在小胶质细胞分支点处表现出STOP行为（完全停顿或仅进入一个子分支）。这表明分支点强烈地限制了Ca²⁺事件的传播，其概率显著高于偶然预期。值得注意的是，部分事件在暂停后仍会恢复传播（STOP-GO行为）。这种分区化行为与传播方向（Toward或Away）无关。

2.4 生理性小胶质细胞Ca²⁺活动显著依赖于嘌呤能信号

鉴于胞体和突起Ca²⁺事件的动态特征存在差异，它们可能受不同的信号通路调控。通过药理学实验发现，广谱嘌呤能P2受体拮抗剂Suramin可同时显著降低胞体和突起的Ca²⁺事件频率。而选择性P2Y12受体拮抗剂Clopidogrel则仅显著降低突起Ca²⁺事件的频率，对胞体事件无显著影响。这提示P2Y12信号是突起Ca²⁺活动的主要调节者，而胞体Ca²⁺活动则可能更多依赖于其他嘌呤能受体。

2.5 推测的神经元活动影响生理性小胶质细胞Ca²⁺活动的基线水平

为了探究神经元活动对小胶质细胞Ca²⁺活动的影响，研究者应用了河豚毒素（TTX）以抑制神经元动作电位。结果显示，TTX处理显著降低了突起Ca²⁺事件的频率，而对胞体事件影响较小。这一效应模式与Clopidogrel处理相似，提示小胶质细胞对神经元活动的反应在很大程度上受到P2Y12信号的影响。

讨论

本研究采用无偏、定量的方法，揭示了小胶质细胞Ca²⁺活动具有时空多样性的动态特征。Ca²⁺信号的传播既非被动也非随机，而是表现出强烈的方向性偏好，并在突起分支点受到主动调控。药理学实验表明，细胞外ATP/UDP等嘌呤能信号，特别是通过P2Y12受体，是生理状态下小胶质细胞突起Ca²⁺活动的重要驱动因素。同时，推测的神经元活动也通过影响嘌呤能信号环境，基线性地调节着小胶质细胞的Ca²⁺活动。

这些发现与微glial各突起功能独立的特点相吻合。高度局域化的突起Ca²⁺事件及其在分支点受到的限制，使得小胶质细胞能够对不同突触及的局部信号进行独立处理和响应。P2Y12信号在介导小胶质细胞对神经元活动反应中的关键作用，也提示了其在微环境监视和潜在神经保护功能中的重要性。

小胶质细胞内质网（ER）可能的不连续分布，为解释Ca²⁺信号在突起中的局域化传播提供了潜在的细胞结构基础。未来研究需要同时成像神经元和小胶质细胞的Ca²⁺活动，并克服在胶质细胞中表达红色基因编码钙指示剂（GECI）的技术挑战，以更精确地揭示神经元-小胶质细胞互作的时空动力学。

总之，本研究提供了一种可靠、灵敏且高效的方法来量化小胶质细胞亚细胞水平的Ca²⁺活动变化，为深入理解具有复杂形态的小胶质细胞如何整合信号并执行其多样化功能开辟了新的途径。