《Journal of Neuroscience Methods》：Optimizing Stereotaxic Injection Strategy for AAV-Mediated Corticospinal Tract Tracing in Mice
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CST追踪方法优化研究通过单次AAV注射实现跨颈椎至腰椎高效标记，发现AP 0.0-+0.7mm/ML1.2mm或ML+0.7-+1.5mm坐标与2周注射间隔可保证L2及更上级别轴突标记效果，较传统多注射四周方案减少操作复杂度。
魏 Wang | 张德汉 | 李少龙 | 王文昭 | 金全和 | 张驰 | 刘杰 | 孙海健 | 冯世清
山东大学齐鲁医学院齐鲁医院骨科，中国山东省济南市250012
摘要
背景
皮质脊髓束（CST）是控制自主运动的重要下行运动通路。虽然腺相关病毒（AAV）介导的前向追踪方法被广泛用于标记小鼠中的CST投射，但最佳的立体定向注射坐标和注射后间隔仍不清楚。
新方法
在此，我们系统评估了八种皮质注射策略，这些策略在前后（AP）和内外（ML）坐标、注射点数量以及注射后间隔方面有所不同。通过转导轴突计数（TAC）、平均荧光强度（MFI）和背柱内的转导面积（均以C2节段为基准进行归一化），在颈椎2、颈椎5、胸椎2、胸椎6和腰椎2的脊髓水平上对CST标记进行了定量评估。
结果
在测试的不同AP/ML坐标以及单点注射与多点注射的情况下，TAC和MFI在颈椎和胸椎水平上大体相当，但IV组（AP +0.70 mm）的L2标记效果较差。此外，将注射后间隔从四周缩短至两周并未影响标记效率。
与现有方法的比较
传统的CST追踪通常需要多次注射和≥4周的间隔，这增加了复杂性和时间成本。我们优化的单次注射、两周的方案在保持标记效果的同时，减少了操作负担并提高了重复性。
结论
我们建议，可以通过在AP坐标0.0至+0.7 mm（ML固定在1.2 mm）或ML坐标+0.7至+1.5 mm（AP固定在0.0 mm）进行单点注射，从而有效标记L2及其上游节段的CST。这些结果为CST追踪建立了一种简化且可重复的策略。
引言
皮质脊髓束（CST）是哺乳动物中枢神经系统中最显著且功能最重要的下行运动通路之一（Duan等人，2017年；Nudo和Masterton，1988年）。CST轴突起源于运动皮层第V层的锥体皮质脊髓运动神经元（CSMN）（Arlotta等人，2005年），并穿过脑干到达脊髓（Stanfield，1992年）。在小鼠中，CST轴突在脊髓中形成三个部分：位于对侧背侧的背侧CST（dCST，Gulgun Sengul，2015年）、位于对侧背外侧白质的背外侧CST（dlCST）以及位于同侧腹内侧束内的腹侧CST（vCST，Bareyre等人，2005年）。dCST是小鼠中的主要通路，因此也是我们后续分析的重点（Steward等人，2004年）。CST轴突在多个脊髓节段终止，直接与下级运动神经元形成突触或通过中间神经元间接形成突触（Miller，1987年）。从功能上看，CST对于执行自主、精细和复杂的运动至关重要，尤其是手和手指等远端肢体的运动（Lemon，2008年）。啮齿动物CST的变化被广泛用作评估中枢神经系统损伤（如脊髓损伤、中风）后轴突再生和功能恢复的关键指标（Cheng等人，2022年；Mu等人，2024年）。
CST轴突的前向追踪是一种强大的可视化轴突投射的方法。在可用的追踪方法中，AAV介导的基因传递因其高神经元趋向性、在有丝分裂后神经元中的持续基因表达以及较低的免疫原性而成为一种强大且广泛使用的方法（Ojala等人，2015年；Kaplitt等人，2007年）。当AAV颗粒被注射到运动皮层的第V层时，它们会被CSMN的细胞体和树突吸收，并沿着轴突运输，使荧光报告蛋白（如GFP、tdTomato）在整个CST长度上积累。尽管这种方法被广泛使用，但实现一致CST标记的最佳立体定向参数和注射后间隔仍不够明确。不同实验室之间存在很大差异（表1）。
在这项研究中，我们系统评估了八种针对小鼠CSMN的皮质注射方法。鉴于有证据表明，投射到不同脊髓节段的皮质脊髓轴突在颈椎水平上是在外侧束中混合分布的，而不是按照体节拓扑排列的（Lemon和Morecraft，2023年），我们使用三个互补指标（1）转导轴突计数（TAC）、（2）平均荧光强度（MFI）和（3）转导面积（表示为单侧背白质的百分比）来评估标记效果。为了控制病毒摄取和表达的个体差异，每个节段的标记结果都以C2脊髓水平为基准进行了归一化。这八种注射方法在前后（AP）和内外（ML）坐标上有所不同，注射点数量从1到4个不等，使我们能够系统地评估空间定位对CST投射的影响。
我们的目标是确定能够在颈椎、胸椎和腰椎节段产生稳健且可重复的CST纤维标记的皮质注射坐标。这些发现有助于优化未来CST追踪和基因传递研究的最佳立体定向参数选择。
研究动物
实验中使用了8周大的成年雌性C57BL/6小鼠（Charles River Laboratories Animal Company，北京，中国）。山东大学第二齐鲁医院的实验动物伦理委员会批准了这些动物实验（KYLL2024242）。小鼠被饲养在山东大学的动物模型研究中心，处于标准化的无特定病原体（SPF）条件下。所有手术和实验程序均严格遵守相关规范。
C2作为稳定的归一化参考
在所有组中，C2值在两个指标上均表现出中等程度的个体间差异。对于C2处的TAC（绝对计数），组平均值范围为0.9–1.6×103（例如，II组平均值为1,373；VI组为1,138），而C2处的MFI范围较广（例如，IV组平均值为38.9；V组为61.6）。这种变异性促使我们在尾部分析中以C2为基准进行归一化。
四点注射与两点注射（I组与II组）
在C5、T2、T6和L2各节段，两点注射与四点注射之间的平均差异在TAC和MFI上均接近于0。
讨论
在这项研究中，我们系统比较了不同基于AAV的皮质注射策略标记小鼠CST的效果。通过分析标记轴突在颈椎、胸椎和腰椎节段上的转导面积和MFI，我们确定了影响CST追踪空间范围和一致性的关键立体定向参数。我们的发现为优化皮质AAV传递以进行前向CST标记提供了实用指南。
结论
总之，我们的数据表明，在最佳皮质坐标（AP = 0 mm，ML = 1.2 mm，DV = –0.7 mm）进行单次AAV注射，并在注射后两周，足以实现从颈椎到腰椎节段的有效CST标记。基于这些结果，我们假设使用AP坐标0至+0.7 mm（ML = 1.2 mm）或ML坐标+0.7至+1.5 mm（AP = 0 mm）进行2周的注射间隔，可以实现L2及其上游节段的有效CST标记。
未引用的参考文献
(Radhiyanti等人，2021年；Liu等人，2010年；Hutson等人，2016年；Tennant等人，2011年)
资助
本工作得到了山东省泰山学者计划-攀登泰山学者（tspd20210320）、国家自然科学基金（82220108005）、山东省博士后科学基金（SDCX-ZG-202400008）和山东大学第二医院培养基金（2023YP17）的资助。
CRediT作者贡献声明
金全和：软件、数据管理。
刘杰：监督、软件、方法学。
张驰：方法学、正式分析。
冯世清：项目管理、资金获取、概念构思。
孙海健：写作-审稿与编辑、项目管理、资金获取。
李少龙：数据管理、正式分析、方法学。
魏 Wang：写作-初稿、资源获取、方法学、数据管理。
王文昭：方法学、数据管理。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢山东大学转化医学核心设施提供的咨询和仪器支持。
人工智能（AI）工具
在准备这项工作时，作者使用了ChatGTP 4.0来提高语言表达的清晰度。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。
