蚕豆组织培养与遗传转化优化方案的建立及其在作物育种中的应用

《Legume Science》：An Optimised Protocol for Faba Bean (Vicia faba L.) Tissue Culture and Transformation

本研究针对蚕豆(Vicia faba L.)组织培养与遗传转化困难的问题，开发了一套高效、可重复的优化方案。通过评估33个基因型并优化激素组合，发现1.5 mg/L IAA可显著促进根系形成；利用基因枪法转化胚胎，在Tiffany品种中实现11.7%的转化效率，并证实转基因可稳定遗传。该方案成功解决了酚类物质积累和生根变异等难题，为蚕豆基因编辑(CRISPR)和分子育种奠定了技术基础。

　　

优化蚕豆组织培养与遗传转化的方案

引言

蚕豆(Vicia faba L.)作为一种重要的豆科作物，因其固氮能力和营养价值而备受关注。然而，其遗传改良进程一直受到组织培养和遗传转化困难的制约。蚕豆生产面临生物和非生物胁迫、产量稳定性低等诸多挑战，且传统育种周期长达15年。尽管CRISPR等新兴基因编辑技术为作物育种带来了革命性机遇，但蚕豆对组织培养再生的顽固性限制了这些技术的应用。以往的研究多采用农杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法，但转化效率低、耗时长。本研究旨在开发一套适用于不同蚕豆基因型的高效、可重复的组织培养和遗传转化方案。

材料与方法

研究选取了33个蚕豆基因型，包括来自德国、加拿大和英国的19个栽培品种以及14个育种系。以成熟种子和新鲜胚胎为外植体，通过调整培养基成分和激素组合，系统优化了愈伤组织诱导、芽再生和根形成等关键步骤。在愈伤组织诱导阶段，比较了六种培养基(MS+02至MS+06)的效果，并发现黑暗条件更有利于愈伤组织的形成。芽再生阶段测试了MS+11至MS+13培养基，其中MS+12因含有激动素(KIN)而表现出最佳的胚胎发生愈伤组织形成能力。根形成优化实验则重点评估了NAA、IBA和IAA三种生长素在四种浓度(0.1, 0.5, 1.0, 1.5 mg/L)下的效果。

遗传转化采用基因枪法(particle bombardment)，以切除的胚胎为靶组织，使用含有绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因的pLH6000载体。转化后，胚胎先在MS1培养基上培养10天以促进芽再生，随后转移到添加IAA的MS2培养基上诱导生根。通过PCR分析和GFP荧光检测确认转基因植株，并评估了T₀和T₁代中转基因的稳定性。

结果

组织培养培养基的优化

基因型间在愈伤组织诱导中存在显著差异。在光照条件下，Alexia和Fuego等品种在MS+02、MS+04和MS+06培养基上直接再生，但伴随大量酚类物质产生。转为黑暗培养后，Fuego在MS+02、MS+04和MS+06上成功诱导出愈伤组织，而育种系FB-0073、FB-0110和品种Yukon则在MS+09培养基上产生白色、易碎的胚胎发生愈伤组织。MS+02产生紧实的褐色愈伤组织，MS+04形成柔软的浅黄色愈伤组织，MS+06则生成具有高增殖潜力的易碎白色愈伤组织。MS+09培养基(含3 mg/L 2,4-D)显著提高了先前不响应基因型的愈伤组织诱导率。

在芽再生方面，MS+11和MS+12能有效促进FB-0073基因型中紧实胚胎发生愈伤组织的形成，而MS+13则更有利于芽的伸长和绿化。以品种Tiffany为模型，MS1培养基能高效促进芽的再生，但根系形成不佳。

不同激素对根再生的影响分析

双因素方差分析(ANOVA)表明，激素类型和浓度对根形成均有显著影响(p < 0.001)。IAA在所有浓度下均表现出最高的生根效率，其次是IBA和NAA。1.5 mg/L IAA处理时根形成数量最多(平均每株5.00条根)，即使在最低浓度(0.1 mg/L)下也能诱导 substantial 根形成(平均每株3.67条根)。相比之下，NAA的生根效率最低。将优化后的1.5 mg/L IAA浓度应用于其余32个基因型，均成功诱导了根的形成，证明了该方案的广谱适用性。

Tiffany和Hedin/2高效遗传转化体系的建立

利用基因枪法转化Tiffany和Hedin/2品种的胚胎，转化后48小时通过共聚焦显微镜检测到GFP荧光，证实了基因的瞬时表达。PCR扩增潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因获得了735 bp的特异性条带，表明转基因已稳定整合。在初步实验中，200株Tiffany植株中有151株(75.5%)、12株Hedin/2植株中有8株(66.7%)呈GFP阳性。然而，多数T₀代植株在移栽至土壤后未能存活，主要归因于根系发育不完全以及从离体条件到温室环境的过渡应激。在后续专注于评估转基因遗传的实验中，通过确保植株在根系充分发育后再移栽，显著提高了成活率。

T1代转基因稳定性的确认

转化60个Tiffany胚胎后，再生出21株植株，其中7株经PCR证实为GFP阳性，T₀代转化效率为11.7%。从这些阳性植株中，三个株系(TG4, TG9, TG18)产生了可育种子并进入T₁代分析。TG4株系的2株T₁代植株、TG9株系的2株T₁代植株以及TG18株系的1株T₁代植株，PCR检测均显示出735 bp的HPT基因条带，证实了转基因可稳定遗传给后代。

讨论

用于再生的优化组织培养培养基

本研究建立了一套高效、可靠的组织培养方案。黑暗培养以及MS+09等特定激素组合的应用，有效克服了酚类物质积累的难题，并促进了顽固基因型的愈伤组织诱导。MS1培养基能有效促进Tiffany品种的芽再生，但根系形成不足，这反映了豆科植物芽和根器官发生对激素需求的不同。IAA，特别是1.5 mg/L浓度，被证明是诱导根形成最有效的生长素。降低培养基中的蔗糖浓度(从30 g/L降至25 g/L)也有助于改善根的形成，这可能通过减轻渗透胁迫来实现。该优化方案在32个额外基因型中的成功应用，证明了其强大的通用性，解决了组织培养中基因型依赖性响应不一致的长期难题。

蚕豆品种遗传转化的进展

本研究成功建立了基于基因枪法的蚕豆遗传转化体系。尽管初始转化率(GFP阳性率)很高，但T₀代植株的低存活率凸显了充分根系发育和渐进式驯化的重要性。在后续实验中，通过延长离体生根阶段确保了植株健康，从而获得了可育的T₀代植株并证实了转基因的稳定遗传。11.7%的转化效率显著高于以往农杆菌介导的蚕豆转化报道(通常为2%-6%)。培养基的优化(MS1用于芽再生，MS2含IAA用于根发育)是转化后再生成功的关键。该方案在Tiffany和Hedin/2两个品种上的成功，展示了其可扩展性和可靠性，为其他蚕豆品种乃至豆科作物的遗传改良提供了有价值的参考。

结论

本研究建立了一套全面优化的蚕豆再生和遗传转化方案。优化的培养基成分显著提高了33个测试基因型的芽再生和根形成效率。通过基因枪法转化获得了GFP阳性植株，并在T₁代中证实了转基因的稳定遗传，验证了该转化体系的可靠性。该方案为将有益基因导入优良蚕豆品种、加速其育种进程提供了强有力的技术支撑，尤其为克服豆科作物组织培养再生困难的瓶颈提供了实践基础。