《New Biotechnology》：Enhanced glutathione production in
Saccharomyces cerevisiae via transporter activation and catabolic pathway engineering
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本研究针对如何高效生物合成谷胱甘肽(GSH)这一关键问题，开展了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中通过过表达转运蛋白(GXA1/GEX2)及敲除降解途径基因(如DUG2、URE2)以提升产量的主题研究。结果表明，工程菌株G1/2-GXA1 ΔDUG2在高密度补料分批发酵中实现了2.8 g/L的GSH产量，为目前不添加纯前体氨基酸条件下的最高报道水平，对推动GSH在食品、医药等领域的工业化生产具有重要意义。
在生命科学的微观世界里，谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一种至关重要的三肽分子，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成。它在维持细胞氧化还原平衡、清除活性氧物种（Reactive Oxygen Species, ROSs）以及抵御氧化应激等方面扮演着核心角色。正是由于其卓越的抗氧化和生理功能，谷胱甘肽在制药、食品和化妆品工业中备受青睐，全球市场需求持续增长。然而，如何经济高效地大规模生产这种珍贵的分子，一直是生物制造领域面临的挑战。
传统的化学生产方法往往步骤繁琐、成本高昂且可能产生环境污染。因此，利用微生物作为“细胞工厂”进行生物合成，成为了更具吸引力的替代方案。其中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其“公认安全”（Generally Recognized as Safe, GRAS） status 以及易于进行遗传操作等优点，被广泛用作生产谷胱甘肽的理想工业平台。在酵母细胞内，谷胱甘肽的合成遵循一个两步酶促途径：首先，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH1）催化谷氨酸和半胱氨酸结合形成γ-谷氨酰半胱氨酸；随后，谷胱甘肽合成酶（GSH2）在此中间产物上添加甘氨酸，最终生成还原型谷胱甘肽（GSH）。然而，这个看似简单的过程却受到精细而复杂的调控。其中，GSH1催化的反应是整个合成途径的限速步骤，并且会受到细胞内积累的GSH的反馋抑制（Feedback Inhibition）。这意味着，当细胞内的谷胱甘肽浓度达到一定水平时，它会反过来抑制自身的合成，从而限制了产量的进一步提升。这就像一条拥堵的生产线，成品堆积会减缓原料的投入速度。
另一方面，细胞为了维持内部环境的稳定（稳态），不仅会合成谷胱甘肽，也会通过降解和消耗途径来处置“过剩”的谷胱甘肽。主要的降解途径被称为DUG途径，涉及Dug1、Dug2和Dug3等蛋白的协同作用，将谷胱甘肽分解回其组成氨基酸。此外，谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferases, GSTs）如Gtt1和具有GST样活性的Ure2蛋白，会催化谷胱甘肽与各种亲电物质结合，这个过程虽然有助于解毒，但也消耗了大量的谷胱甘肽。Ure2还有一个重要功能，即作为氮分解代谢阻遏（Nitrogen Catabolite Repression, NCR）的负调控因子，影响着细胞对氮源的利用。这些消耗途径就像工厂里的“泄洪闸”，不断分流着宝贵的产物。
以往的研究多集中于强化合成途径本身，例如过表达GSH1和GSH2基因。虽然取得了一定成效，但单纯依靠“开源”往往难以突破反馋抑制和降解消耗造成的瓶颈。因此，科学家们开始思考更为集成的策略：能否在促进合成的同时，主动将产物运出细胞以减轻反馋抑制，并关闭那些不必要的“泄洪闸”，从而将更多的资源汇集到目标产物上？这正是发表在《New Biotechnology》上的这项研究旨在回答的核心问题。
为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术。他们以实验室常用的酿酒酵母D452-2菌株及其已强化GSH1和GSH2表达的衍生株G1/2为出发菌株。遗传操作方面，核心采用了CRISPR/Cas9基因组编辑系统，用于精确敲除目标基因；同时利用酵母整合质粒（YIPs）过表达特定基因。发酵工艺上，关键采用了葡萄糖限制的高细胞密度补料分批发酵策略，以最大化生物量和产物产量。分析检测则主要依赖高效液相色谱（HPLC）技术，用于精确测定细胞生长、底物消耗（如葡萄糖）以及产物（胞内外谷胱甘肽）的浓度。
3.1. 谷胱甘肽输出蛋白过表达对酿酒酵母胞内外谷胱甘肽积累的影响
研究人员首先探讨了过表达谷胱甘肽输出蛋白对生产的影响。他们将编码ABC转运蛋白的GXA1基因和编码质子耦合反向转运蛋白的GEX2基因，分别导入到已强化合成的G1/2菌株中，构建了G1/2-GXA1和G1/2-GEX2工程菌。 batch发酵结果表明，与亲本G1/2菌株相比，两个输出蛋白过表达菌株不仅将分泌到培养基中的谷胱甘肽浓度提高了28%-32%，其胞内的谷胱甘肽含量和浓度也在发酵48小时达到了峰值，分别提升了26%-32%和37%-38%。这一发现具有重要意义，它证实了通过促进产物外排来解除反馋抑制的策略是有效的。过表达的转运蛋白可能通过将谷胱甘肽从合成位点（细胞质）转运至胞外或细胞器（如液泡），降低了胞质内的GSH浓度，从而解除了对GSH1的反馋抑制，促进了合成的持续进行。此外，部分被输出的谷胱甘肽也可能通过如OPT1等输入蛋白被重新吸收，间接贡献了胞内积累。
3.2. 基因敲除对酿酒酵母胞内谷胱甘肽积累的影响
在确认输出蛋白过表达的有效性后，研究团队进一步将目光投向减少谷胱甘肽的胞内消耗。他们选择了G1/2-GXA1菌株作为背景，利用CRISPR/Cas9技术系统地敲除了七个与谷胱甘肽分解代谢或消耗相关的基因：DUG1、DUG2、DUG3（DUG途径关键组分）、GCG1（编码一种胞质γ-谷氨酰环化转移酶类似蛋白）、GTT1（编码一种谷胱甘肽S-转移酶）、URE2（编码具有GST样活性的氮代谢调控蛋白）以及VPS27（ESCRT-0复合体亚基，参与蛋白分选）。 batch发酵筛选结果显示，在G1/2-GXA1基础上敲除DUG2或URE2能显著提升胞内谷胱甘肽含量。在发酵48小时，G1/2-GXA1 ΔDUG2菌株的谷胱甘肽含量和产量比G1/2-GXA1菌株分别提高了26%和20%；而G1/2-GXA1 ΔURE2菌株的提升更为显著，含量增加了46%，产量提高了14%。DUG2是DUG途径中水解谷胱甘肽的关键酶，其敲除直接阻断了主要的降解通路。URE2的敲除则可能通过双重机制起作用：一方面消除了其GST样活性导致的GSH消耗；另一方面，作为NCR的负调控因子，其缺失可能解除了对某些氮代谢相关基因（如编码谷氨酸合成酶的GLT1）的抑制，增加了谷胱甘肽合成前体——谷氨酸的供应。相比之下，敲除GTT1、GCG1等基因对产量提升不明显，提示它们在标准培养条件下对总谷胱甘肽周转的贡献可能有限。敲除VPS27虽提高了胞内含量，但严重损害了细胞生长，导致最终产量并未增加，因此不具有应用优势。
3.3. 补料分批培养及最终生产菌株的筛选
为了在接近工业生产的条件下评估最优菌株，研究人员对在 batch 发酵中表现最好的G1/2-GXA1 ΔDUG2和G1/2-GXA1 ΔURE2菌株进行了葡萄糖限制的高密度补料分批发酵。在这种模式下，通过精确控制葡萄糖 feed 速率，避免乙醇过量生成，从而最大化细胞密度和产物合成。结果表明，虽然两菌株的胞内谷胱甘肽含量相近，但G1/2-GXA1 ΔDUG2菌株表现出更优异的生长性能，其最大干细胞重量（DCW）达到97 g/L，比G1/2-GXA1 ΔURE2菌株高14%。这最终使得G1/2-GXA1 ΔDUG2菌株在发酵80小时后，谷胱甘肽产量达到2.8 g/L，比G1/2-GXA1 ΔURE2菌株高出11%。G1/2-GXA1 ΔURE2菌株生长受损的原因可能与其Ure2蛋白在氮代谢调控和氧化应激应答中的多重功能缺失有关，这在营养限制和氧化压力较高的高密度培养环境中尤为不利。
综上所述，本研究通过整合“开源”（过表达输出蛋白以解除反馋抑制）和“节流”（敲除降解关键基因以减少消耗）的双重代谢工程策略，成功地在酿酒酵母中大幅提升了谷胱甘肽的产量。最终筛选出的工程菌株G1/2-GXA1 ΔDUG2，在未添加纯前体氨基酸的条件下，实现了2.8 g/L的谷胱甘肽产量，这是迄今为止在酿酒酵母中报道的最高水平。这项工作不仅展示了一种高效生产谷胱甘肽的创新方法，凸显了协同调控合成、转运和降解网络在代谢工程中的强大潜力，而且为利用GRAS微生物进行其他高价值化合物的工业化生产提供了重要借鉴。其研究成果对于降低谷胱甘肽的生产成本，促进其在医药、功能性食品和化妆品等领域的更广泛应用具有显著的积极意义。
