《Plant Physiology and Biochemistry》：The small peptide XT-6 promotes seed germination in tobacco
编辑推荐：
本研究针对内源小肽在种子萌发中的作用机制尚不明确的问题，通过整合转录组学与肽组学分析，发现并鉴定了一个新型信号肽XT-6。研究发现，外源施加XT-6能以浓度依赖方式（最适浓度0.5-1 μM）显著提高烟草种子萌发率，而CRISPR/Cas9敲除突变体则萌发延迟。多组学分析揭示XT-6作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过全局性微调翻译效率，精细调控油菜素内酯（BR）生物合成途径及关键转录因子稳定性，从而促进种子从休眠向萌发转变。该研究揭示了肽介导的翻译控制是种子萌发调控中一个先前被忽视的层面，为作物育苗改良提供了新策略。
种子，这看似微小的生命起点，却承载着植物繁衍的使命，其萌发过程是植物生命周期中一个至关重要的发育转折点。在农业生产中，种子萌发的特性——包括萌发率、整齐度和速度——是决定作物产量和品质的首要因素。然而，这一过程并非简单的吸水膨胀，其背后是由内部遗传程序和外部环境信号共同调控的复杂分子网络。长期以来，植物激素的平衡，特别是脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）之间的拮抗作用，被认为是调控种子萌发的经典框架。ABA作为萌发抑制剂维持种子休眠，而GA则通过启动胚乳弱化和动员储藏物质来促进萌发。但越来越多的证据表明，种子萌发的调控网络远比基于激素的模型更为复杂。
近年来，小肽（Small Peptides, SPs）作为一类新型信号分子在植物研究中备受关注。这些小肽通常短于250个氨基酸，在纳摩尔到微摩尔浓度下就能发挥生物学功能。与经典激素类似，它们具有强大的信号传导能力，但由于由多基因家族编码，其功能更具特异性。小肽填补了大蛋白和小激素分子之间的信号传导空白，实现了精确的细胞间通讯。它们已在多种植物生理过程中被证明扮演关键角色，例如CLE肽家族调控根干细胞稳态，系统素作为损伤信号激活系统防御反应，以及多种快速碱化因子（RALF）肽参与胁迫适应等。然而，直接支持内源小肽在种子萌发中作用的实验证据仍然有限，大多数结论依赖于间接发现。
为了全面阐明小肽在种子萌发中的功能和机制，选择一个合适的研究模型系统至关重要。烟草（Nicotiana tabacum）作为一种重要的经济作物和经典模式植物，具有清晰的遗传背景、成熟的遗传转化体系以及稳定的种子萌发研究实验平台，是研究小肽功能的理想选择。近期的高通量肽组学分析已经在烟草种子萌发过程中鉴定出多个差异表达的小肽。例如，低浓度CYS3肽处理被证明可以促进未成熟种子的萌发，这为内源小肽参与萌发调控提供了直接证据。基于小肽常见的信号传导模式，其潜在机制可能包括：通过调控ABA/GA的合成、代谢或信号传导来影响激素平衡；通过受体激酶介导的信号转导途径调控萌发相关基因的表达；或直接参与细胞壁松弛或储藏物动员等生理过程中关键酶活性的调控。尽管现有研究为理解小肽在种子萌发中的作用奠定了基础，但绝大多数与萌发相关的小肽功能仍属未知，其作用机制也有待系统阐明。
在此背景下，研究人员在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了一项研究，旨在系统鉴定与烟草种子萌发不同阶段相关的小肽，并深入探究其功能机制。他们通过整合高通量转录组学和肽组学分析，发现了一个先前未被表征的信号肽——小肽6（XT-6），并证实其是种子萌发的正向调节因子。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们以烟草品种K326为材料，在受控条件下进行种子萌发实验。研究团队首先通过整合转录组学和肽组学数据，动态分析了种子萌发五个关键阶段的基因和肽表达谱，以识别候选功能肽。接着，他们通过外源施加化学合成的候选肽（如XT-6）和利用CRISPR/Cas9技术构建的xt-6基因敲除突变体及过表达株系，在表型水平上验证了XT-6的功能。在机制探索层面，研究人员采用了转录组测序（RNA-seq）来揭示XT-6处理引起的全局基因表达变化，并利用蔗糖密度梯度离心结合核糖体图谱分析（Ribo-seq）技术，精细评估了XT-6对种子萌发过程中翻译效率的影响。所有的组学数据均通过生物信息学方法（如GO和KEGG通路富集分析）进行深入解读，以阐明XT-6作用的潜在分子通路。
3.1. 联合转录组和肽组分析揭示烟草种子萌发的动态调控景观
通过对烟草种子五个萌发阶段（GS1-GS5）的转录组和肽组分析，研究人员发现基因和肽的表达呈现高度动态和阶段特异性的模式。转录组分析显示，差异表达基因（DEGs）的数量在萌发过程中先增后减，其中上调的DEGs在GS3阶段（萌发第3天）达到峰值，而下调的DEGs在GS4阶段（萌发第4天）达到峰值。KEGG通路富集分析表明，不同萌发阶段主导的生物学通路不同：种皮破裂阶段（GS2 vs GS1）主要富集于代谢途径和DNA复制；胚根伸长阶段（GS3 vs GS2）与苯丙烷生物合成等相关；随后的阶段（GS4 vs GS3）则与核糖体、光合作用相关；子叶展开后（GS5 vs GS4）则主要涉及碳固定和光合作用。肽组分析则揭示了不同的时间调控模式：上调的差异表达肽段数量逐渐减少，而下调的肽段先增后减。值得注意的是，肽组和转录组的变化并不同步，肽段水平最显著的变化发生在萌发第3至4天，而基因表达峰值则出现在第2至3天，这暗示了肽段丰度存在转录后层面的调控。
3.2. 鉴定调控种子萌发的候选肽
通过整合转录组和肽组数据并进行交叉比较分析，研究人员筛选出在转录和肽水平上共同调控的肽段。经过分泌信号肽筛选和功能注释，最终确定了5个高优先级候选肽进行深入的功能分析，它们分别是XT-3, XT-5, XT-6, XT-7和XT-8。
3.3. 候选基因对K326种子萌发的影响
通过外源施加候选肽进行萌发实验，研究人员发现XT-6处理能显著加速非饱满种子和高质量种子的早期萌发，尤其在萌发第3天效果最为明显，但这种促进作用不影响最终的萌发率。剂量效应实验表明，XT-6对萌发的促进作用呈浓度依赖性，最适浓度为0.5-1.0 μM，浓度过高（如5.0 μM）反而会抑制萌发，显示出典型的激素样双相反应特征。系统发育分析和序列比对显示XT-6与茄科植物中的肽段聚为一类，其核心功能残基和保守基序高度保守，提示其结构和功能的重要性。
3.4. XT-6过表达和突变体烟草萌发率的变化
为了从遗传学角度验证XT-6的功能，研究人员构建了XT-6过表达（XT-6-OE）和CRISPR/Cas9敲除突变体（xt-6）烟草株系。萌发实验表明，与野生型相比，xt-6突变体的种子萌发率显著降低，而XT-6-OE过表达株系的种子萌发率则显著高于野生型。这一结果从正反两个方面证实了XT-6在促进烟草种子萌发中的积极作用。
3.5. XT-6处理对种子萌发影响的转录组学分析
为了阐明XT-6促进萌发的分子机制，研究人员对XT-6处理和未处理的烟草幼苗进行了比较转录组分析。结果鉴定出881个上调基因和1239个下调基因。GO富集分析显示，这些差异表达基因显著富集于脂肪酸代谢、细胞壁（CW）组织、小分子代谢过程等生物过程，以及细胞壁、质膜等细胞组件，以及转移酶活性、丝氨酸型内肽酶活性等分子功能。值得注意的是，与细胞壁组织或生物发生相关的基因主要被下调，提示XT-6可能通过调控细胞壁重塑来影响胚根突破等关键萌发步骤。KEGG通路分析表明，差异表达基因显著富集于脂肪酸合成、油菜素内酯（BR）生物合成以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢等通路。其中，BR生物合成通路中的基因主要被上调，而BR是已知能促进种子萌发的重要激素。作为功能验证，外源施加高浓度油菜素内酯确实能显著促进种子萌发，这为BR通路在XT-6介导的萌发促进中的核心作用提供了支持。
3.6. XT-6在种子萌发中作用的翻译组学分析
通过蔗糖密度梯度离心分析核糖体谱，研究人员发现XT-6处理导致植物细胞内多核糖体比例略有下降，而核糖体小亚基和大亚基的相对含量显著升高，这表明XT-6处理引起了全局翻译效率的抑制。进一步的翻译组（Ribo-seq）与转录组整合分析证实，XT-6处理导致了许多基因的翻译效率发生变化。GO和KEGG富集分析显示，翻译效率差异基因显著富集于核糖体通路，并且该通路中20个核心核糖体蛋白基因的翻译效率呈现协同下调。序列分析表明XT-6编码一个具有保守的马铃薯I型蛋白酶抑制剂结构域的胰蛋白酶抑制剂样蛋白，这与其在转录组中显示出的丝氨酸型内肽酶抑制剂活性相吻合。
综上所述，本研究通过多组学整合分析、功能验证和机制探索，鉴定并阐明了一个新型小肽XT-6在促进烟草种子萌发中的关键作用及其独特的作用机制。研究结果表明，XT-6作为一个丝氨酸蛋白酶抑制剂，虽然在一定程度上全局性地抑制了翻译效率，但却能特异性地上调油菜素内酯生物合成等关键通路，从而正向调控种子萌发。这种看似矛盾的调控方式——即全局抑制与特定通路激活并存——可能是一种精细的调控策略，有助于在萌发这一关键发育转折点优化资源分配和协调生理过程。该研究不仅首次揭示了XT-6的功能，更重要的是提出了“肽介导的翻译控制”是种子萌发调控网络中一个先前被忽视的重要层面。这一发现革新了对小肽信号功能的认识，将小肽的作用从传统的信号传导扩展到了翻译调控这一新维度，为理解植物发育过程中的精确调控提供了新视角。此外，XT-6作为一种潜在的天然萌发促进剂，在农业生产中具有重要的应用前景，为改善作物育苗、提高作物产量和品质提供了新的思路和靶点。该研究也凸显了整合多组学技术在挖掘新型功能分子和揭示复杂生物学过程调控机制中的强大威力。
