《Plant Physiology and Biochemistry》：VvmiR408 positively modulates seedlessness formation by cleaving
VvAGL61 in grape berries
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本研究针对葡萄无核化这一关键农艺性状，揭示了VvmiIR408通过靶向剪切MADS-box基因VvAGL61调控种子发育的新机制。研究人员通过RLM-RACE/PPM-RACE验证切割位点，结合转基因烟草实验证实该模块在种子败育中的核心作用，为高品质无核葡萄育种提供了关键靶点。
葡萄作为世界性的重要水果，其无核性状一直是育种家和消费者关注的焦点。无核葡萄不仅提升了鲜食的便利性，也对加工产业具有重要价值。然而，葡萄种子败育的分子调控机制尚未完全阐明，这限制了高品质无核葡萄品种的选育进程。在植物中，微小核糖核酸（miRNA）作为重要的转录后调控因子，通过引导靶基因mRNA的降解或翻译抑制，在植物生长发育中发挥关键作用。其中，miR408是一个在植物中高度保守的miRNA，此前研究多集中于其在营养生长、胁迫应答等方面的功能，而其在种子发育，特别是无核性状形成中的角色尚不明确。同时，MADS-box转录因子家族成员VvAGL61作为种子发育的正向调控因子，其上游调控机制也有待揭示。
为解析葡萄无核性状形成的分子基础，南京农业大学园艺学院的研究团队在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了最新研究成果。该研究以有核葡萄品种'Wink'和无核品种'京科晶'为材料，通过分子生物学、生物信息学和转基因功能验证等手段，系统揭示了VvmiR408-VvAGL61模块在葡萄种子败育过程中的核心调控作用。
研究采用的关键技术包括：利用RLM-RACE（RNA连接酶介导的5'cDNA末端快速扩增）和PPM-RACE（多聚腺苷酸聚合酶介导的3'cDNA末端快速扩增）技术验证VvmiR408对VvAGL61的切割位点；通过组织特异性表达分析揭示该模块在种子发育过程中的时空表达模式；构建VvMIR408过表达载体并转化烟草，进行功能验证；利用生物信息学工具对VvmiR408及其靶基因进行系统进化、保守结构域和基因结构分析。实验材料来源于江苏省农业科学院溧水植物科学基地提供的葡萄品种。
种子发育的形态学特征分析
通过对'Wink'和'京科晶'葡萄花序/果穗、浆果和胚珠/种子在不同发育阶段的形态观察发现，无核品种'京科晶'的种子在花后40-60天出现褐化、萎缩和胚乳退化现象，表明其种子败育发生在这一关键时期。而有核品种'Wink'的胚珠则保持正常发育进程，最终形成成熟种子。
VvmiR408的鉴定与特征分析
研究成功克隆并鉴定了葡萄VvmiR408的成熟序列及其初级转录本基因。VvMIR408基因全长507bp，可形成稳定的茎环二级结构。染色体定位显示该基因位于葡萄第7号染色体上。比较基因组学分析表明，VvmiR408的成熟序列在多种植物物种中高度保守。
靶基因验证与切割活性分析
生物信息学预测和实验验证表明，VvAGL61是VvmiR408的真正靶基因。RLM-RACE和PPM-RACE分析证实，VvmiR408在VvAGL61互补位点的第10个核苷酸处进行特异性切割。VvAGL61基因全长804bp，编码一个包含MADS结构域的267个氨基酸的蛋白质。系统进化分析显示，VvAGL61与草莓等物种的AGL61同源蛋白亲缘关系最近。
VvmiR408-VvAGL61模块的相反表达模式
在种子发育过程中，VvmiR408与VvAGL61表现出显著的时空表达拮抗关系。在无核品种'京科晶'中，VvmiR408在花后40天的种子败育期表达达到峰值（增加3.8倍），而其靶基因VvAGL61的表达量极低；而在有核品种'Wink'中，VvAGL61在花后40天的种子发育期表达显著升高（增加11倍），VvmiR408表达量则接近零。这种相反的表达模式在浆果组织中尤为明显，且在'Kyoho'和'京早晶'等品种中得到进一步验证。
VvMIR408过表达抑制烟草种子发育
转基因烟草功能验证表明，过表达VvMIR408可显著降低烟草中NtAGL61同源基因的表达水平，导致烟草植株矮化、角果皱缩、种子数量减少且出现败育现象。这进一步证实了VvmiR408通过下调AGL61表达促进种子败育的功能。
研究结论表明，VvmiR408-VvAGL61是调控葡萄种子发育的关键模块，其中VvmiR408通过剪切VvAGL61 mRNA促进种子败育，而VvAGL61作为MADS-box转录因子正向调控种子发育。这一发现不仅丰富了植物miRNA调控种子发育的理论基础，也为无核葡萄分子育种提供了新的靶点。值得注意的是，与拟南芥、水稻等物种中miR408通过调控光合作用相关基因提高种子产量的功能不同，葡萄中的VvmiR408通过靶向AGL61这一种子发育关键基因，展现了物种特异性的调控功能。这种功能多样性反映了miRNA在不同植物物种中调控网络的复杂性。
该研究的创新性在于首次揭示了VvmiR408在葡萄无核性状形成中的核心作用，并明确了其与VvAGL61的调控关系。研究建立的分子调控模型为理解植物种子败育机制提供了新视角，对葡萄无核育种实践具有重要指导意义。未来需要进一步探究该模块在不同葡萄种质中的等位变异及其与其它种子发育相关基因的互作网络，以更全面地解析无核性状形成的分子基础。
