《Scientifica》：Improvement of In Vitro Seed Germination and Shoot Development of the Indonesian Endangered Orchid, Dendrobium lineale Rolfe, Using Sucrose and Coconut Water
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本文研究了蔗糖与椰汁（CW）对印尼濒危兰花Dendrobium lineale Rolfe非共生种子萌发及芽体发育的影响。研究发现，在Vacin and Went（VW）培养基中添加20 g/L蔗糖可显著提高种子萌发率（89%）和芽体形成（阶段5，46%）；而添加20%椰汁则能有效促进芽体后续发育，提高根系数量、叶片数及鲜重。该研究为濒危兰花的离体大规模繁殖及保护提供了高效可行的技术方案。
1. 引言
兰科（Orchidaceae）是植物界第二大科，约有29,524个物种，然而约25%的兰花物种因过度采挖、非法贸易及栖息地丧失而面临灭绝威胁。Dendrobium lineale Rolfe是一种具有重要观赏价值的兰花，作为杂交亲本被广泛应用，其原产于印度尼西亚巴布亚岛，但因栖息地破坏与过度开采已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ。利用离体种子培养技术进行非共生萌发，可在较短时间内大量繁殖兰花，是濒危兰花保护的有效手段。影响兰花种子非共生萌发的因素包括培养基类型、蔗糖浓度及有机添加物等。本研究旨在探究蔗糖与椰汁（CW）对D. lineale种子萌发及芽体发育的影响，建立高效离体繁殖技术体系。
2. 材料与方法
2.1. 蒴果采集与灭菌
人工授粉后3个月的成熟蒴果采自印尼东爪哇DD兰花苗圃。蒴果经10%洗涤剂清洗10分钟，无菌水冲洗3次后，用5%次氯酸钠溶液灭菌10分钟，再经无菌水冲洗3次，于超净工作台中纵向剖开，取出种子。
2.2. 种子形态观察
30粒种子在尼康立体显微镜下观察并记录形状、颜色、胚胎形态等特征。
2.3. 组织学分析
种子经FAA固定、酒精梯度脱水、石蜡包埋后，切片厚度8 μm，经 safranin 和 fast green 染色，显微镜下观察胚胎结构，并测量种子与胚胎长度和宽度。
2.4. 蔗糖对种子萌发及原球茎发育的影响
种子分别播种于添加0、10、20、30 g/L蔗糖的VW固体培养基（含2 g/L Phytagel，pH 5.7），每处理重复3次，每重复5瓶，每瓶约200粒种子。培养1、2、3个月后观察胚胎发育阶段，按以下标准分级：阶段0：种子未萌发；阶段1：胚胎膨大，种皮完整；阶段2：种皮破裂（萌发）；阶段3：胚胎脱离种皮（原球茎）；阶段4：原球茎具芽顶端分化；阶段5：原球茎具1–3片叶（芽体）。
2.5. 椰汁对芽体发育的影响
萌发3个月后，长约6–10 mm、具1–2片叶的芽体转接至添加0%、5%、10%、15%、20% CW的VW培养基，培养4个月后统计根数、叶数及鲜重。
2.6. 实验设计与数据分析
采用完全随机设计，数据经SPSS 22软件进行ANOVA分析， Duncan多重比较检验（α=0.05）。
3. 结果
3.1. 种子形态与解剖结构
D. lineale种子呈纺锤形，透明，长546 μm，宽120 μm。胚胎椭圆形，浅橙色，长450 μm，宽85 μm，占据种子大部分空间，无胚乳，种皮无保护结构。
3.2. 种子离体萌发与原球茎发育过程
培养2周后胚胎膨大、转绿（阶段1）；3周后种皮破裂（阶段2）；随后胚胎发育为圆形、浅绿色原球茎（阶段3）；原球茎长达677 μm时出现根毛及芽顶端分化（阶段4），继而形成第一、二片叶（阶段5），最终在蔗糖培养基中形成根。
3.3. 蔗糖对萌发及原球茎发育的影响
培养1个月时，0、10、20、30 g/L蔗糖处理的萌发率分别为5.6%、46.0%、76.6%、86.7%，无处理形成阶段5芽体；2个月时，20 g/L与30 g/L蔗糖处理分别有12%与35%的芽体进入阶段5；3个月时，20 g/L蔗糖处理萌发率最高（89%），阶段5芽体比例达46%，而无蔗糖处理萌发率仅20.7%，且无阶段5芽体形成。
3.4. 椰汁对芽体发育的促进作用
添加20% CW的VW培养基中，芽体根系数（6.5条/株）、叶数（6.3片/株）及鲜重（0.38 g）均显著高于其他处理，芽体发育良好。
4. 讨论
兰花种子缺乏碳水化合物储备，离体萌发需外源蔗糖提供碳源与渗透调节。本研究中20 g/L蔗糖显著促进D. lineale萌发与原球茎发育，与Dendrobium strebloceras、Paphiopedilum lowii等研究结果一致。椰汁中富含生长素、细胞分裂素等植物激素，可促进细胞分裂与根系形成。20% CW添加能显著提升芽体生物量与器官分化，与Bulbophyllum auricomum、Orchis simia等研究相符。
5. 结论
VW培养基添加20 g/L蔗糖可高效促进D. lineale种子非共生萌发（萌发率89%，阶段5芽体46%）；20% CW则显著优化芽体根系与叶片发育。本研究建立了D. lineale离体高效再生体系，为其保育与复壮提供技术支撑。
