RIPK3磷酸化MFN2调控内质网-线粒体互作在心肌细胞程序性坏死中的关键作用及机制研究

《Redox Biology》：RIPK3-Driven Phosphorylation of MFN2 Orchestrates Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Interaction and Cardiomyocyte Stress Responses

本研究聚焦于心肌缺血/再灌注损伤中程序性坏死的重要机制。研究人员发现，RIPK3可通过磷酸化MFN2蛋白的Thr130位点，增强内质网-线粒体相互作用，导致线粒体Ca2+超载，进而诱导线粒体通透性转换孔开放并激活Calpain1抑制线粒体自噬，最终促进心肌细胞程序性坏死。该研究揭示了死亡受体通路与线粒体坏死通路之间的新联系，为心脏保护提供了潜在治疗靶点。

　　

心肌缺血/再灌注损伤是临床上常见的心血管急症，即使成功恢复血流供应，心肌组织仍可能遭受更严重的损伤，这种现象被称为心肌缺血/再灌注损伤。在这种损伤过程中，心肌细胞的死亡方式多种多样，其中程序性坏死近年来被证实是重要的细胞死亡形式之一。程序性坏死主要包括死亡受体介导的外源性通路和线粒体内源性通路，但这两条通路之间如何"对话"，它们之间的联络机制是什么，这一直是领域内亟待解决的关键科学问题。

更深入地说，内质网和线粒体作为细胞内的两个重要细胞器，它们之间的相互作用在维持细胞钙稳态、脂质合成和能量代谢中发挥着关键作用。当这种相互作用失衡时，可能会导致线粒体钙超载，进而诱导线粒体通透性转换孔的持续开放，最终引起细胞死亡。线粒体融合蛋白2（MFN2）是调控内质网-线粒体相互作用的关键分子，但其在心肌程序性坏死中的作用尚不完全清楚。

正是在这样的背景下，青岛大学附属医院综合内科的研究团队在《Redox Biology》上发表了一项重要研究，系统地阐明了RIPK3通过磷酸化MFN2调控内质网-线粒体相互作用，进而促进心肌程序性坏死的分子机制。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过过氧化氢（H₂O₂）诱导的H9c2心肌细胞坏死模型和小鼠左前降支结扎再灌注的体内模型模拟心肌缺血/再灌注损伤；采用免疫共沉淀和免疫荧光技术检测蛋白质相互作用；利用质谱分析鉴定MFN2的磷酸化位点；使用定制化的MFN2 Thr130磷酸化特异性抗体进行功能研究；通过ddGFP系统和流式细胞术检测内质网-线粒体相互作用；利用钙离子荧光探针Rhod-2-AM监测线粒体钙水平；构建心脏特异性MFN2基因敲除小鼠验证其在体功能。

1. MFN2促进了氧化应激下线粒体mPTP开放和心肌程序性坏死

研究发现，在H₂O₂处理的H9c2细胞中，MFN2蛋白水平显著上调。通过基因敲低和过表达实验证实，MFN2能够促进H₂O₂诱导的心肌细胞程序性坏死，表现为PI阳性细胞增加、LDH释放增多以及mPTP开放增强。这些结果表明MFN2在心肌程序性坏死中发挥促进作用。

2. MFN2通过增强内质网-线粒体相互作用促进线粒体钙超载

研究人员发现，H₂O₂处理可显著增加内质网-线粒体相互作用和线粒体钙水平。MFN2敲低能够明显减弱这种相互作用和钙超载，而过表达MFN2则产生相反效果。这表明MFN2通过调控内质网-线粒体相互作用来影响线粒体钙稳态。

3. RIPK3促进内质网-线粒体相互作用和后续的线粒体钙积累

研究显示，RIPK3在H₂O₂处理的心肌细胞中表达上调和磷酸化激活。敲低RIPK3可显著抑制程序性坏死，同时减弱内质网-线粒体相互作用和线粒体钙积累，而过表达RIPK3则增强这些效应。

4. RIPK3可磷酸化MFN2的Threonine 130位点

通过免疫共沉淀和免疫荧光实验，研究人员证实RIPK3与MFN2存在直接相互作用。质谱分析鉴定出MFN2的Thr130是RIPK3的主要磷酸化位点。使用特异的磷酸化抗体进一步验证，RIPK3确实可磷酸化MFN2的Thr130位点，且该位点对于MFN2调控内质网-线粒体相互作用和线粒体钙积累至关重要。

5. RIPK3通过MFN2促进内质网-线粒体相互作用和线粒体钙积累

研究发现，RIPK3过表达诱导的程序性坏死、mPTP开放、内质网-线粒体相互作用和线粒体钙超载，均可被MFN2敲低所逆转。这表明RIPK3通过调控MFN2来发挥其促进程序性坏死的作用。

6. Calpain1激活和线粒体自噬受损是线粒体钙超载诱导心肌程序性坏死的主要原因

研究人员发现，线粒体钙超载可激活Calpain1，进而抑制线粒体自噬起始。敲低Calpain1可恢复线粒体自噬，改善线粒体功能，并减轻程序性坏死。重要的是，MFN2或RIPK3过表达诱导的程序性坏死可被Calpain1敲低所抑制，表明Calpain1位于RIPK3/MFN2信号通路的下游。

7. MFN2缺陷可显著减轻缺血/再灌注损伤诱导的心肌程序性坏死

在体实验表明，心脏特异性MFN2基因敲除小鼠在经历缺血/再灌注损伤后，心肌梗死面积和坏死细胞数量显著减少，心功能明显改善，进一步证实了MFN2在心肌缺血/再灌注损伤中的关键作用。

研究结论表明，RIPK3驱动的MFN2磷酸化是连接死亡受体通路和线粒体坏死通路的重要桥梁。该信号轴通过增强内质网-线粒体相互作用，导致线粒体钙超载，一方面直接诱导线粒体通透性转换孔开放，另一方面通过激活Calpain1抑制线粒体自噬，共同促进心肌程序性坏死的发生。这一发现不仅深化了对心肌缺血/再灌注损伤机制的理解，而且为开发针对性的心脏保护策略提供了新的理论依据和治疗靶点。特别是MFN2 Thr130位点的磷酸化作为潜在的药理学干预靶点，具有重要的转化医学价值。