《Redox Biology》：Tumor-intrinsic redox programming drives an SPP1-CD44 axis of immune suppression in uveal melanoma
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本研究针对葡萄膜黑色素瘤(UM)免疫治疗抵抗的难题，通过单细胞RNA测序技术揭示了肿瘤细胞氧化还原稳态通过SPP1-CD44信号轴介导CD8+T细胞功能抑制的新机制，为靶向代谢-免疫串扰的联合治疗策略提供了理论依据。
在成人眼内恶性肿瘤中，葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)虽然罕见却极具侵袭性，近半数患者会发生远处转移，尤其好发于肝脏。更令人困扰的是，这种肿瘤对包括免疫检查点抑制剂在内的系统治疗反应不佳，其背后的机制一直困扰着研究人员。与传统认知中"免疫冷肿瘤"的特征相符，UM表现出低肿瘤突变负荷、稀疏的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)以及功能耗竭的T细胞群体。然而有趣的是，当把这些T细胞从肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中分离出来进行体外培养时，它们的功能可以重新被激活，这暗示着肿瘤微环境中的某些因素在主动抑制免疫细胞功能。
近年来，肿瘤代谢与免疫应答之间的相互作用成为癌症研究的热点。越来越多的证据表明，肿瘤细胞通过重塑自身的代谢程序，不仅满足快速增殖的能量需求，还主动调节免疫细胞的功能。特别是在氧化还原平衡方面，活性氧(reactive oxygen species, ROS)作为关键的信号分子，在肿瘤进展和免疫调节中扮演着双重角色。然而，在葡萄膜黑色素瘤中，肿瘤细胞的内在代谢特征如何影响免疫微环境，尤其是如何导致CD8+T细胞功能抑制，仍然是一个未解之谜。
为了解决这一科学问题，研究人员在《Redox Biology》上发表了最新研究成果。他们通过对9例原发UM样本进行单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)，构建了高分辨率的肿瘤和免疫细胞图谱，深入解析了UM的细胞异质性和细胞间通讯网络。
研究团队主要运用了单细胞转录组测序技术分析临床样本，通过生物信息学方法进行细胞分群、差异基因分析和通路富集，利用SCENIC分析转录因子调控网络，采用CellChat进行细胞间通讯预测，并通过体外实验验证关键发现，包括细胞共培养、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western blot、流式细胞术和Seahorse能量代谢分析等。
1. 单细胞 landscapes of primary UM
研究人员首先对来自5例患者的9个原发UM样本进行了单细胞RNA测序，成功获得了81,695个高质量细胞的转录组数据。通过细胞类型鉴定，他们识别出10种主要细胞类型，包括黑色素瘤细胞、T细胞、自然杀伤(natural killer, NK)细胞、B细胞和浆细胞、肥大细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周细胞/血管平滑肌细胞。值得注意的是，肿瘤顶端区域(apical tumor regions, AT)与基底边缘区域(basal margin regions, BM)的细胞组成存在显著差异：AT区域富含黑色素瘤细胞，而BM区域则富含成纤维细胞，提示不同肿瘤区域具有不同的微环境特征。
2. Subtype delineation of UM cells
通过对33,587个黑色素瘤细胞的深入分析，研究人员识别出五个转录特征不同的肿瘤亚群。其中，TXN+MEL细胞主要富集于AT区域，表现出强烈的细胞周期活性和内质网应激反应，同时具有活跃的MYC、mTOR和E2F信号通路。这些特征表明该亚群处于高代谢状态和强烈的蛋白质合成压力下。相比之下，DCT+MEL细胞主要分布在BM区域，表达黑色素细胞分化标志物，而TGM2+MEL细胞则表现出上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)特征，可能与肿瘤侵袭性相关。
3. TXN+MEL represents a metabolically adaptive UM subpopulation
进一步分析发现，TXN+MEL细胞具有最强的抗氧化能力，能够有效维持氧化还原平衡。通过SCENIC分析，研究人员发现这一亚群中HMGA1、JUND、CEBPB等转录因子活性显著升高，这些因子与抗氧化防御和应激适应密切相关。这种氧化还原适应状态使得TXN+MEL细胞能够在高代谢压力下维持生存，并可能通过分泌特定因子影响免疫微环境。
4. Immune suppression and T cell dysfunction in UM
对5,919个T细胞的深入分析揭示了UM中T细胞的功能状态。研究人员识别出9个不同的T细胞亚群，包括 na?ve/早期活化CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)、Th17细胞、效应CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、自然杀伤T细胞和干扰素刺激基因高表达(ISG-High) T细胞。值得注意的是，AT区域的T细胞表现出更强的耗竭特征，而BM区域的T细胞则显示出更强的活化状态，这与不同肿瘤区域的代谢特征相呼应。
5. Crosstalk between tumor cells and T cells identifies an immunosuppressive SPP1-CD44 signaling axis
通过细胞间通讯分析，研究人员发现TXN+MEL细胞是信号输出的主要来源，而效应CD8+T细胞则是主要的信号接收者。特别值得注意的是，SPP1-CD44配体-受体对被认为是肿瘤细胞与T细胞之间最重要的通讯方式。免疫荧光染色结果进一步证实了SPP1+的黑色素瘤细胞与CD44+的CD8+T细胞在空间上的紧密相邻，为这一相互作用提供了形态学证据。
6. SPP1 bridges tumor redox state and CD8+T cell suppression in UM
功能实验表明，UM细胞分泌的SPP1水平显著高于正常黑色素细胞。通过体外共培养实验，研究人员证实SPP1能够显著抑制CD8+T细胞的增殖和效应功能，表现为Ki-67和IFN-γ表达下降。重要的是，这种抑制作用依赖于CD44受体，因为使用抗CD44抗体阻断这一相互作用后，T细胞的功能得以恢复。机制上，研究人员发现适度的ROS水平有助于维持SPP1的表达和分泌，而使用Mito-LND（一种靶向线粒体的氧化磷酸化抑制剂）人为提高ROS水平后，会引发内质网应激，进而下调SPP1的表达。
研究结论与讨论部分指出，这项工作首次在葡萄膜黑色素瘤中揭示了肿瘤细胞氧化还原代谢与免疫抑制之间的直接联系。TXN+MEL细胞通过维持特定的氧化还原状态，保障SPP1的持续分泌，进而通过CD44受体抑制CD8+T细胞的功能。这一ROS-SPP1-CD44轴的发现不仅为理解UM的免疫抵抗机制提供了新的视角，也为开发新的治疗策略指明了方向。针对这一轴的干预措施，如联合使用氧化磷酸化抑制剂和SPP1-CD44信号阻断剂，可能成为增强UM免疫治疗效果的新途径。
这项研究的创新之处在于将肿瘤代谢、蛋白质分泌和免疫调节三个看似独立的过程有机地联系起来，揭示了它们在UM发生发展中的协同作用。尽管研究存在样本量有限、缺乏体内验证模型等局限性，但其发现为理解UM的免疫抑制微环境提供了重要线索，为开发针对代谢-免疫串扰的精准治疗策略奠定了理论基础。
