《Scientia Horticulturae》：Whole-genome identification and expression analysis of the
nuclear factor Y gene family in response to drought and salt stresses in
Helianthus annuus L?
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本研究针对向日葵(Helianthus annuus L.)在干旱和盐胁迫下的耐受机制，系统鉴定了NF-Y转录因子基因家族。研究人员通过全基因组分析鉴定出56个HaNF-Y基因，发现其启动子区域富含多种胁迫响应顺式元件，并通过RNA-seq和qRT-PCR验证了HaNF-YA5、HaNF-YA7、HaNF-YB4等基因在胁迫下的显著表达变化，为向日葵抗逆育种提供了重要靶基因资源。
作为世界第四大油料作物，向日葵(Helianthus annuus L.)在保障全球粮食安全和优化人类饮食结构方面具有不可替代的战略地位。然而，其生产力常常受到干旱和高盐等不利环境条件的严重制约。随着气候变化和全球人口增长对农业带来严峻挑战，培育抗逆性强的作物品种已成为当务之急。在这一背景下，系统解析向日葵的耐逆机制及其关键调控因子，将为育种改良提供重要理论基础。
核因子Y(NF-Y)是一类高度保守的转录因子家族，它们通过NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基形成异源三聚体复合物，作为基因表达网络中的核心调控元件，在植物生长、发育和环境适应中发挥关键作用。特别是在非生物胁迫响应中，NF-Y转录因子通过ABA依赖和非依赖信号通路参与调控过程，被认为是植物防御系统中的"分子开关"。尽管NF-Y基因家族在拟南芥、水稻等模式植物中已有较为深入的研究，但在向日葵这一重要经济作物中，其全基因组特征和进化关系尚不明确。
为了解决这一知识空白，浙江大学作物科学研究所及浙江省作物种质创新与利用重点实验室的研究团队在《Scientia Horticulturae》上发表了最新研究成果。该研究通过整合生物信息学分析和实验验证，首次对向日葵NF-Y基因家族进行了全面系统的鉴定和功能分析。
研究人员主要运用了全基因组扫描、系统进化分析、基因结构特征分析、顺式元件预测、染色体定位与基因复制分析、共线性分析、蛋白互作网络构建、转录组分析以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)等关键技术方法。其中，转录组分析利用了公共数据集SRP092742，涵盖了向日葵11种不同组织和盐旱胁迫处理样本；qRT-PCR实验则以向日葵栽培种SH361为材料，分析了150mM NaCl和10%/20% PEG-6000处理下的基因表达变化。
3.1. 向日葵NF-Y基因家族的鉴定和特征
通过BLAST和隐马尔可夫模型(HMM)联合搜索，结合InterPro和CDD数据库验证，研究团队在向日葵基因组中鉴定出56个独特的HaNF-Y基因成员，包括13个HaNF-YA、27个HaNF-YB和16个HaNF-YC。这些基因编码的蛋白质在序列长度(68-381个氨基酸)、理论等电点(4.55-10.41)和分子量(7.98-43.18 kDa)等方面表现出高度变异性，其中仅有10个蛋白质被预测为稳定蛋白(不稳定性指数<40)。亚细胞定位预测显示，所有HaNF-Y家族成员均定位于细胞核，而HaNF-YC亚家族中的7个成员还表现出细胞质和细胞核的双重定位特征。
3.2. 向日葵和拟南芥NF-Y基因的系统发育关系
通过多序列比对和系统发育分析，研究人员将向日葵和拟南芥的NF-Y蛋白分为三个主要分支，每个亚家族的成员大多聚集在一起。研究发现了4对向日葵和拟南芥之间的直系同源基因对，以及11对向日葵内的旁系同源基因对(3对HaNF-YAs、6对HaNF-YBs和2对HaNF-YCs)。这种高度的同源性表明它们可能具有保守的生物学功能，同时也暗示了该基因家族内存在遗传冗余和功能分化的可能性。
3.3. HaNF-Y家族成员 motif、保守结构域和基因结构分析
对56个HaNF-Y蛋白的motif分析发现，同一亚家族内的蛋白质具有相似的motif组成。HaNF-YA成员仅包含一个motif(Motif3)，HaNF-YB主要包含Motif1、Motif2、Motif4、Motif7和Motif9，而HaNF-YC亚家族主要包含Motif1、Motif5、Motif6、Motif8和Motif10，其中Motif5存在于所有HaNF-YC蛋白中。保守结构域分析显示，所有HaNF-YA蛋白均含有CBFB_NFYA结构域，HaNF-YB亚家族包含HFD_NFYB和HFD_Dr1结构域，HaNF-YC亚家族则包含HFD_NFYC-like、HFD_POLE4-like和HFD_DRAP1结构域。基因结构分析表明，同一亚家族内的HaNF-Y基因具有高度相似的外显子-内含子组织，进一步支持了进化分析的可靠性。
3.4. HaNF-Y基因启动子区域的顺式作用元件
研究人员在HaNF-Y基因的启动子区域鉴定出59种顺式作用元件，可分为光响应元件、激素响应元件、生长发育相关元件、胁迫响应元件等五类。特别值得注意的是，所有HaNF-Y基因的启动子区域都富含参与激素和胁迫响应的顺式元件，共鉴定出133个ARE(厌氧诱导)、114个ABRE(脱落酸响应)、62个TGACG和62个CGTCA motif(茉莉酸甲酯响应)。这些元件的富集表明HaNF-Y家族可能在ABA、MeJA和厌氧响应等关键信号通路中发挥作用。
3.5. 56个HaNF-Y基因的染色体分布和基因复制
HaNF-Y基因不均匀地分布在向日葵的16条染色体上(除Chr6外)，其中Chr14包含最多的HaNF-Y基因(8个)，而Chr5、Chr12和Chr15各仅含1个基因。基因复制分析发现了14对复制基因对，全部为片段复制，Ka/Ks比值均小于1，表明HaNF-Y基因在进化过程中经历了强烈的纯化选择。
3.6. 种间共线性分析
通过构建向日葵与三种双子叶植物(拟南芥、莴苣和番茄)和两种单子叶植物(玉米和水稻)的全基因组水平比较共线性图谱，研究发现向日葵与双子叶物种的亲缘关系更近。其中，47对直系同源基因显示向日葵与莴苣NF-Y基因存在共线性，其次是番茄(30对/23个基因)和拟南芥(15对/11个基因)，而与玉米和水稻仅各共享5对/4个基因。
3.7. HaNF-Y基因家族的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络
蛋白质互作网络分析显示，49个HaNF-Y蛋白(12个HaNF-YA、23个HaNF-YB和14个HaNF-YC)之间存在复杂的相互作用。HaNF-YB3和HaNF-YB6具有最高的连接度，而HaNF-YB22、HaNF-YB24、HaNF-YB26以及HaNF-YC12、HaNF-YC13、HaNF-YC15的连接度最低。总体而言，HaNF-YB亚家族的连接度高于HaNF-YA亚家族，而HaNF-YC亚家族在三个亚家族中连接度最弱。
3.8. HaNF-Y基因在向日葵不同组织中的表达模式
HaNF-Y基因的表达表现出强烈的组织特异性。例如，HaNF-YC8和HaNF-YC9在花粉中优势表达，HaNF-YB11主要在花柱和舌状花中活跃，而HaNF-YB10在花粉、根和盘花子房中高表达。值得注意的是，HaNF-YB7、HaNF-YB12等9个基因在所有组织中表达水平较低，而HaNF-YA3、HaNF-YB5等6个基因在11种组织中均高表达。
3.9. HaNF-Y基因在盐和干旱胁迫条件下的表达分析
RNA-seq分析显示，许多HaNF-Y基因在盐和干旱胁迫下表现出明显的表达变化。在盐胁迫下，HaNF-YA2、HaNF-YA5、HaNF-YA12等在叶片中表达显著升高，而HaNF-YA10、HaNF-YB10等在叶片中表达降低。在干旱胁迫下，HaNF-YA2、HaNF-YA5、HaNF-YA7等在叶片中表达上调，而HaNF-YA10表达降低。这些结果表明HaNF-Y基因可能广泛参与向日葵对非生物胁迫的适应性响应。
3.10. HaNF-Y基因表达的实时荧光定量PCR分析
通过qRT-PCR对8个选定的HaNF-Y基因(HaNF-YA5、HaNF-YA7、HaNF-YA12等)在干旱和盐处理下的表达进行分析，发现这些基因在向日葵根和叶中的表达水平变化显著。在20% PEG处理下，除HaNF-YA5和HaNF-YC8显著上调外，大多数选定基因在根中的表达水平显著下调。在叶片中，HaNF-YA5在两种盐处理浓度下均显著增加，而HaNF-YC8在300mM NaCl、10% PEG和20% PEG处理下表达显著抑制。
研究结论和讨论部分强调，NF-Y转录因子作为植物生长、发育和多种生理过程的主要调控因子，在植物适应各种环境挑战中发挥关键作用。本研究首次在向日葵中系统鉴定了NF-Y基因家族，揭示了其在进化过程中的分化和保守性。通过比较向日葵和拟南芥NF-Y基因的一对一直系同源关系，为推断其功能奠定了基础。
特别值得注意的是，研究发现HaNF-YB5和HaNF-YB6共享相同的蛋白质序列，且在PPI实验中，HaNF-YB6蛋白与其他NF-Y蛋白的互作程度最高，表明HaNF-YB6可能是提高耐旱性的优先候选基因。同时，某些HaNF-Y基因如HaNF-YA5对盐胁迫表现出显著响应，这与其它物种中NF-Y基因参与盐胁迫响应的研究结果一致。
然而，本研究仅使用了XRQ品种的全基因组信息作为参考基因组，单个物种的参考基因组无法完全反映群体的遗传多样性。未来的研究可以进一步探索泛基因组作为NF-Y基因家族表征的新参考，以更准确地阐明NF-Y基因的进化历史，并为向日葵NF-Y基因的多样化提供新视角。
该研究的综合分析为向日葵NF-Y基因家族的进化和多样化生物学功能研究奠定了基础，确定的候选基因为向日葵分子育种提供了宝贵的靶基因资源，对培育抗逆性强的向日葵品种具有重要指导意义。整合功能测定与泛基因组分析，将最终弥合基因家族表征与可操作的向日葵改良遗传工具之间的差距。
