病毒性出血性败血症病毒基因IVa型反向遗传学系统的建立及其在抗病毒化合物筛选中的应用

《Virologica Sinica》：Development of the reverse genetics system for viral hemorrhagic septicemia virus genotype IVa and its application in antiviral compound screening

本研究针对严重威胁全球水产养殖的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)，成功构建了基因IVa型VHSV株(VHSVLB2018)的反向遗传学平台。研究人员利用双RNA聚合酶I/II转录载体，在哺乳动物和鱼类细胞中成功拯救了重组病毒，并构建了表达EGFP和Cherry荧光蛋白的重组病毒株。表型分析显示，未修饰的重组病毒与野生型病毒生长动力学和毒力相似，而荧光蛋白表达变体则表现出减毒复制和毒力。利用rVHSV-EGFP株进行抗病毒化合物筛选，鉴定出三种有效抑制剂：黄腐酚、没食子酸辛酯和粗糠柴毒素。该反向遗传学系统为研究VHSV致病机制、开发减毒活疫苗和筛选抗病毒化合物提供了多功能平台。

　　

在水产养殖业快速发展的今天，病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)作为一种高度传染性的病原体，对淡水和海水鱼类造成了严重威胁，导致全球水产养殖业遭受重大经济损失。VHSV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)的新弹状病毒属(Novirhabdovirus)，其单股负链RNA基因组编码6种蛋白。根据G基因序列，VHSV可分为四种主要基因型，其中基因IVa型在北美和亚洲地区均有分布，但不同分离株之间存在显著的遗传差异。

2018年，研究人员在中国南方从大口黑鲈(Micropterus salmoides)中分离到一株基因IVa型VHSV毒株(VHSVLB2018)。基因组比较分析显示，该毒株与其他亚洲分离株的核苷酸同源性仅为93.45%-96.42%，并且在N、P和Nv蛋白中存在独特的氨基酸替换。这种遗传差异可能意味着该毒株具有独特的生物学特性，因此迫切需要建立专门的研究工具来深入探索其致病机制并开发有效的防控策略。

反向遗传学系统作为病毒学研究的重要工具，能够实现对病毒基因组的精确操作，为研究病毒复制、致病机制以及开发疫苗和抗病毒药物提供了强大平台。虽然此前已有VHSV反向遗传学系统的报道，但针对中国分离的VHSV基因IVa型毒株的反向遗传学平台尚未建立。为此，中山大学海洋科学学院的研究团队在《Virologica Sinica》上发表了他们的最新研究成果。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用双RNA聚合酶I/II转录系统构建全长cDNA克隆；通过迷你基因组实验验证反向遗传学系统的功能性；在哺乳动物细胞(B7GG)和鱼类细胞系(FHM和EPC)中拯救重组病毒；利用荧光显微镜、流式细胞术、RT-PCR和Western blot等技术对重组病毒进行鉴定；通过一步生长曲线实验和体内毒力试验评估病毒表型；建立基于荧光报告病毒的高通量抗病毒筛选平台；采用时间加药实验确定抑制剂的作用阶段。实验所用的大口黑鲈样本来自实验室养殖群体。

质粒构建和功能验证

研究人员首先通过PCR扩增获得VHSVLB2018株的全长基因组片段，并将其克隆到含有锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)序列的PVAX1载体中，成功构建了全长cDNA克隆PVAX1-rVHSV。为了便于后续研究，他们还在全长质粒中插入了EGFP和Cherry报告基因，分别构建了PVAX1-rVHSV-EGFP和PVAX1-rVHSV-Cherry。通过迷你基因组实验验证了该反向遗传学系统的功能性，实验结果显示，在共转染支持质粒(PVAX1-N、PVAX1-P和PVAX1-L)的情况下，B7GG细胞中可观察到明显的绿色荧光，表明病毒RNA依赖的RNA聚合酶复合体具有活性，能够识别并处理迷你基因组的末端序列。

在哺乳动物和鱼类细胞系中高效拯救重组VHSV

研究人员将全长质粒与支持质粒共转染B7GG细胞，成功拯救出重组病毒。透射电镜观察显示，重组病毒感染FHM细胞后可引起典型的细胞病变效应(CPE)，包括细胞变圆、脱落和最终裂解。表达荧光蛋白的重组病毒在感染细胞中显示出清晰的绿色或红色荧光，证实了重组病毒的成功拯救。值得注意的是，该拯救过程不仅在哺乳动物B7GG细胞中有效，在鱼类细胞系FHM和EPC中同样能够成功拯救重组病毒，表明该反向遗传学系统具有较好的适用性。

重组VHSV生产的确认

通过RT-PCR和Western blot分析进一步验证了重组病毒的成功拯救。PCR分析显示，重组病毒感染细胞中可检测到VHSV G基因的特异性条带(688 bp)，与野生型病毒感染组一致。Western blot分析也检测到分子量为57.1 kDa的VHSV G蛋白条带，这些结果充分证明了重组病毒能够在体外有效复制。

重组VHSV的生长动力学

一步生长曲线实验显示，野生型VHSV在感染后第8天达到峰值滴度(10^8.1PFU/mL)，而未修饰的重组病毒rVHSV表现出相似的生长模式，峰值滴度为10^8.2PFU/mL。然而，表达荧光蛋白的重组病毒显示出减毒生长表型：rVHSV-EGFP和rVHSV-Cherry的峰值滴度分别为10^6.3PFU/mL和10^6.2PFU/mL。这些结果表明，虽然所有重组病毒都保留了体外复制能力，但荧光蛋白表达变体的复制能力明显减弱。

重组VHSV的体内毒力

体内毒力实验结果表明，野生型VHSV感染组的大口黑鲈在3天内全部死亡，存活率为0%。rVHSV感染组也表现出相似的毒力，所有鱼在4天内死亡。相比之下，rVHSV-EGFP株的毒力显著降低，最终存活率为4.08%；rVHSV-Cherry株也显示出毒力减弱，最终存活率为18.2%。这些数据表明，外源基因的插入确实会导致病毒毒力的减弱，这为开发减毒活疫苗提供了可能。

使用rVHSV-EGFP进行抗病毒化合物筛选

利用rVHSV-EGFP建立的筛选平台，研究人员评估了7种化合物对VHSV复制的抑制作用。细胞毒性实验确定了各化合物的安全使用浓度。筛选结果显示，黄腐酚(10 μmol/L)、没食子酸辛酯(5 μmol/L)和粗糠柴毒素(10 μmol/L)表现出显著的抗病毒活性，抑制率分别为91.42%、85.13%和90.63%。剂量依赖实验进一步证实了这三种化合物的抗病毒效果，随着化合物浓度的增加，GFP荧光强度和病毒N基因表达水平均呈现浓度依赖性下降。

黄腐酚、没食子酸辛酯和粗糠柴毒素对VHSV感染不同阶段的影响

时间加药实验揭示了这三种化合物的作用机制：黄腐酚和粗糠柴毒素主要靶向病毒复制阶段，而没食子酸辛酯则干扰病毒的内化过程。值得注意的是，这三种化合物都不影响病毒对宿主细胞的附着。这种阶段特异性的抑制作用为开发联合用药策略提供了理论依据。

研究结论与讨论部分指出，本研究成功建立了VHSV基因IVa型毒株的反向遗传学系统，该系统不仅为研究病毒致病机制提供了重要工具，而且为开发抗病毒策略奠定了基础。荧光蛋白标记的重组病毒特别是rVHSV-EGFP，作为高通量抗病毒筛选平台显示出巨大潜力。鉴定出的三种抑制剂（黄腐酚、没食子酸辛酯和粗糠柴毒素）具有不同的作用机制，为开发针对VHSV的新型抗病毒药物提供了候选化合物。

该研究的创新性在于首次针对中国分离的VHSV基因IVa型毒株建立了反向遗传学平台，并成功将其应用于抗病毒化合物筛选。荧光报告病毒的使用使研究人员能够实时、定量地监测病毒复制，大大提高了筛选效率。此外，研究发现的外源基因插入位点对病毒表型的影响，为今后优化病毒载体疫苗设计提供了重要参考。

这项研究不仅深化了对VHSV生物学特性的理解，而且为水产养殖业的病毒病防控提供了新的技术手段和药物候选物。建立的技术平台还可推广应用于其他水产病毒的研究，对保障水产养殖业的可持续发展具有重要意义。随着后续研究的深入，这些发现有望转化为实际应用，为全球水产养殖业的健康发展做出贡献。