《Virologica Sinica》：Multivalent display of Envelope protein domain III with Mi3 nanoparticles induces protective immunity against lethal Zika virus infection in mice
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为应对寨卡病毒(ZIKV)疫苗研发中存在的抗体依赖增强(ADE)风险，研究人员开展了利用Mi3纳米颗粒展示ZIKV包膜蛋白结构域III(EDIII)的疫苗策略研究。该研究证实Mi3-EDIII纳米疫苗可激发高水平中和抗体和细胞免疫，在母体免疫和干扰素α/β受体敲除(Ifnar1-/-)小鼠模型中均能有效抵抗致死性ZIKV攻击，且免疫血清未显示登革病毒(DENV)感染增强效应，为安全高效的寨卡疫苗设计提供了新思路。
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种由伊蚊传播的黄病毒，自2015年在巴西暴发大规模疫情以来，被发现与新生儿小头畸形和成人吉兰-巴雷综合征等严重神经系统疾病密切相关，被世界卫生组织列为国际关注的突发公共卫生事件。尽管疫情在2017年后有所缓和，但作为ZIKV和登革病毒（dengue virus, DENV）共同传播媒介的埃及伊蚊栖息地已从热带、亚热带地区扩展至温带地区，大大增加了ZIKV再次流行的风险。目前，尚无特异性抗病毒药物或预防性疫苗获批用于临床，针对ZIKV感染的干预策略仍局限于蚊媒控制、限制前往流行区旅行以及对症治疗。因此，研发一种安全、有效且具有成本效益的疫苗迫在眉睫。
ZIKV疫苗研发的一个主要安全顾虑是ZIKV与DENV之间的抗体依赖增强（antibody-dependent enhancement, ADE）效应。这是由于ZIKV与DENV之间存在抗原相似性，其氨基酸同源性高达56%。自然感染ZIKV或DENV，或接种针对任一病毒的疫苗，都可能诱导产生交叉反应但无中和或中和能力较弱的抗体。这些抗体无法有效阻断异源DENV毒株的后续感染，反而会通过Fcγ受体（FcγR）介导的机制促进病毒进入宿主细胞，从而加剧疾病严重程度。动物模型和人类队列研究均表明，预先存在的抗ZIKV抗体可在DENV感染时加重病情，这为安全ZIKV疫苗的设计带来了复杂挑战。
与其他黄病毒类似，ZIKV病毒颗粒包含三种结构蛋白：衣壳蛋白（Capsid, C）、前膜蛋白/膜蛋白（prM/M）以及包膜蛋白（Envelope, E）。其中，E蛋白，特别是其结构域III（EDIII），在病毒与细胞受体相互作用、病毒进入和融合过程中起关键作用。值得注意的是，ZIKV的EDIII与DENV的EDIII相似性较低（约29%），远低于结构域I（EDI）和结构域II（EDII）。因此，EDIII有潜力引发高强度的型特异性中和抗体（neutralizing antibodies, nAbs），且可能减少交叉反应抗体带来的ADE风险。然而，EDIII本身的免疫原性较弱，成为其作为疫苗靶点的主要限制因素。
为此，发表在《Virologica Sinica》上的这项研究，探索了一种新型ZIKV疫苗策略，即利用Mi3纳米颗粒多价展示ZIKV EDIII，旨在增强其免疫原性并评估其保护效果及安全性。
为开展本研究，作者运用了几项关键技术：利用SpyTag/SpyCatcher共价连接系统将ZIKV EDIII与自组装Mi3纳米颗粒偶联构建疫苗；通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征纳米颗粒；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、生物层干涉技术（BLI）分析抗原抗体结合；通过基于流式细胞术的中和试验（FNT）和酶联免疫斑点试验（ELISpot）分别评估体液免疫和细胞免疫；建立了母体免疫后子代鼠攻击模型和Ifnar1-/-成年鼠攻击模型以评价保护效力；并利用人慢性髓系白血病K562细胞模型进行体外ADE风险评估。
Generation and characterization of Mi3-EDIII nanoparticles
研究人员成功构建了Mi3-EDIII纳米颗粒疫苗。他们将SpyCatcher（SC）与Mi3支架的N端融合（SC-Mi3），将SpyTag（ST）与ZIKV EDIII（E蛋白第298至409位氨基酸）的C端融合（EDIII-ST）。通过SC与ST之间自发形成异肽键，EDIII-ST可高效共价连接至SC-Mi3，形成由60个相同亚基组成的二十面体结构。SDS-PAGE分析显示耦合效率持续高于90%。负染电镜观察显示Mi3-EDIII纳米颗粒被EDIII-ST蛋白包围，动态光散射分析表明Mi3-EDIII的直径（43.67 ± 0.30 nm）显著大于未耦合的SC-Mi3（36.40 ± 0.20 nm）。抗原性分析证实，Mi3-EDIII保持了被中和单克隆抗体（如7B3, 8D10）识别的构象表位，并且与单体EDIII-ST或全长E蛋白片段E404相比，其与中和抗体的结合活性更高，平衡解离常数（KD）更低，表明多价排列的EDIII更利于抗体接近。
Immunogenicity of Mi3-EDIII nanoparticles in C57BL/6 mice
在C57BL/6小鼠中评估了Mi3-EDIII的免疫原性。与EDIII-ST亚单位疫苗相比，Mi3-EDIII纳米颗粒疫苗在所有免疫后时间点均诱导了显著更高滴度的EDIII特异性IgG抗体（第三次免疫后高约20倍）和中和抗体。此外，Mi3-EDIII还引发了更强的细胞介导免疫（CMI）反应，表现为脾脏和腹股沟淋巴结（ILNs）中经EDIII多肽池刺激后产生IFN-γ和IL-4的斑点形成细胞（SFCs）数量显著更多。流式细胞术分析进一步显示，Mi3-EDIII免疫组小鼠ILNs中生发中心（Germinal Center, GC）B细胞（B220+GL7+CD95+）的比例显著高于EDIII-ST免疫组，表明其激发GC反应的能力更强，这可能有助于产生高质量抗体。
Maternal immunization with Mi3-EDIII nanoparticles protects the offspring against lethal ZIKV challenge
研究通过母体免疫和新生鼠攻击模型评估了Mi3-EDIII的保护效果。经Mi3-EDIII免疫的母鼠所产子代，在出生后一天接受ZIKV（GZ02株）攻击后，体重持续增长，全部存活，且仅部分出现轻微神经系统症状。相比之下，EDIII-ST和SC-Mi3免疫组的子代出现严重体重减轻、神经系统异常（如肢体和尾巴瘫痪）、脑发育迟缓，并全部死亡。定量实时PCR（qRT-PCR）检测显示，Mi3-EDIII组子代脑组织中的病毒基因组拷贝数比对照组低2-3个数量级。脑组织病理学检查也证实，Mi3-EDIII能有效减轻ZIKV引起的脑膜淋巴细胞浸润和皮质层状坏死。这些结果表明，Mi3-EDIII诱导的保护性免疫（特别是抗体反应）可通过垂直传播保护子代免受ZIKV感染。
Immunization with Mi3-EDIII nanoparticles protects against lethal ZIKV challenge in adult Ifnar1-/-C57BL/6 mice
在成年Ifnar1-/-C57BL/6小鼠模型中，Mi3-EDIII同样展现出优异的免疫原性和保护效力。免疫后，Mi3-EDIII组产生了高水平的EDIII特异性IgG和中和抗体。致死剂量的ZIKV攻击后，Mi3-EDIII免疫组小鼠仅出现轻微体重下降，全部存活，且血清中各时间点病毒载量极低。而EDIII-ST免疫组小鼠虽存活率（80%）高于SC-Mi3对照组（20%），但其血清病毒载量与对照组相当，表明Mi3-EDIII在控制病毒复制方面效果更佳。
Mi3-EDIII immune sera do not enhance DENV infection in K562 cells
安全性评估是本研究的关键环节。体外ADE实验显示，尽管Mi3-EDIII和EDIII-ST免疫血清在特定稀释度下能增强ZIKV在K562细胞中的感染（可能与其中和活性有关），但重要的是，两者均未像ZIKV感染恢复期血清那样，增强所有四种血清型DENV（DENV1-4）的感染。这提示Mi3-EDIII纳米疫苗诱导的抗体基本不包含易导致ADE的抗体类型，降低了潜在风险。
综上所述，该研究成功开发了一种基于Mi3纳米颗粒展示ZIKV EDIII的疫苗策略。研究结果表明，Mi3-EDIII纳米疫苗能有效激发强大的体液免疫和细胞免疫反应，在母体免疫模型和易感成年鼠模型中均能提供针对致死性ZIKV攻击的显著保护，同时其诱导的免疫血清在体外未显示对DENV的ADE效应。这些发现凸显了Mi3纳米颗粒作为疫苗平台在增强抗原免疫原性方面的优势，以及选择EDIII作为靶点以规避ADE风险的潜力。该研究为开发安全、有效的抗ZIKV感染疫苗提供了有前景的候选方案，并对针对其他蚊媒黄病毒的疫苗设计具有重要借鉴意义。研究人员也指出，该疫苗尚未实现完全 sterilizing immunity（ sterilizing immunity），未来可通过优化EDIII结构、联合其他保护性抗原（如非结构蛋白NS1、NS3）以及调整免疫策略等方式进一步提升其保护效力。对ADE风险的全面评估仍需更深入的体内外研究和临床试验验证。
