《Antioxidants》：Enhanced Alarmin Secretion Exacerbates Neutrophil Extracellular Trap (NET) Formation in Active Psoriasis: Implication of IL-33 and TSLP in Driving NET Formation, Inflammation and Oxidative Stress in Psoriasis
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本研究揭示了银屑病中警报素（IL-33和TSLP）通过增强中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，进而驱动外周血炎症反应和氧化应激的新机制。研究证实，活动期银屑病患者体内NET相关标志物（MPO–DNA复合物、CitH3、PAD4等）及警报素表达显著上调，体外实验表明rhIL-33和rhTSLP可诱导中性粒细胞NETosis，其形成的NETs能进一步促进PBMCs产生促炎细胞因子（如IL-6、IL-17、TNF-α）和氧化应激标志物（如MDA、8-OHdG），首次提出了IL-33–TSLP–NETs轴在银屑病发病中的关键作用。
摘要
银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和警报素（Alarmins）在系统性和皮肤炎症中的作用日益受到重视。本研究旨在明确目标警报素（即IL-33和TSLP）在NETs诱导中的作用及其对银屑病患者外周血氧化应激和炎症的后续影响。研究招募了56名活动期银屑病患者和56名对照受试者。通过流式细胞术、ELISA和qPCR分别量化了各组循环中性粒细胞频率、NET相关标志物（MPO–DNA复合物、CitH3、PAD4、NADPH氧化酶、NE）以及警报素转录本（IL-33、TSLP、S100A7、S100B、HSP60/70）的水平。在存在或不存在rhIL-33和rhTSLP的情况下，通过免疫细胞荧光评估了分离中性粒细胞的NET形成潜力。通过ELISA评估了rhIL-33和rhTSLP预处理的NETs在对外周血单个核细胞（PBMCs）上增强氧化应激和炎症的作用。结果显示，与对照组相比，活动期银屑病患者的循环中性粒细胞和NET相关标志物水平显著升高（p < 0.001）。皮损皮肤与正常皮肤相比，MPO表达强烈（p < 0.001）。警报素IL-33和TSLP在血液和皮肤中显著上调（p < 0.05）。经rhIL-33和rhTSLP处理的中性粒细胞在患者中表现出增强的NETosis（p < 0.001）。当PBMCs与rhIL-33和rhTSLP预处理的NETs共孵育时，炎症细胞因子和氧化应激标志物的表达增加。综上所述，本研究揭示了一种新机制，即警报素IL-33和TSLP加剧了NET形成，这可能驱动银屑病中炎症和氧化应激的增强。
1. 引言
银屑病是一种常见的炎症性皮肤病，通常表现为慢性病程，影响全球近2-3%的个体。银屑病的特征包括角质形成细胞过度增殖和分化受损，以及免疫细胞浸润导致表皮增厚和皮肤鳞屑斑块的形成。其病因涉及免疫、遗传和环境等多因素。在过去的十年中，IL-23/IL-17轴被认为是银屑病炎症的关键驱动因素，影响疾病的起始和维持。然而，银屑病并非单纯的适应性免疫疾病。越来越多的证据表明，疾病的最早触发因素在于先天免疫反应的失调，特别是由上皮和免疫来源的警报素引发的反应。这些分子从应激的角质形成细胞、活化的免疫细胞和受损组织中释放，作为内源性危险信号激活免疫系统。其中，S100家族蛋白（S100A7、S100B）、IL-33、TSLP以及HSP60和HSP70已成为炎症的关键调节因子。在健康条件下，警报素执行细胞内管家功能；但当它们释放到细胞外时，会与先天免疫受体（如TLRs和RAGE）结合，引发强烈的炎症级联反应。几种警报素在银屑病皮肤和血清中持续升高，与疾病活动性相关，并有助于角质形成细胞活化、血管生成和免疫细胞募集。此外，中性粒细胞在银屑病皮损中含量丰富，它们积聚在表皮形成Munro微脓肿，并通过分泌蛋白酶、细胞因子和活性氧（ROS）导致组织损伤。除了吞噬作用，其最重要的效应机制之一是NET形成，这是一种特殊形式的细胞死亡（即NETosis），中性粒细胞释放富含酶（如MPO、NE、蛋白酶3）和各种其他炎症蛋白（如CitH3、组织蛋白酶、钙卫蛋白等）的染色质。NETs越来越多地被认为是包括银屑病在内的各种感染性、自身免疫性和炎症性疾病的致病放大器。NETs的组成包含强效的炎症分子，可以激活分泌I型干扰素的pDCs，促进IL-23释放，增强Th17反应，并刺激角质形成细胞增殖。银屑病患者中NET相关标志物（如MPO–DNA复合物、循环CitH3、PAD4和NE水平）持续升高，表明疾病中存在NETosis的慢性升高。尽管有这些观察结果，但警报素对中性粒细胞活化和下游效应途径的确切机制贡献仍未完全明确。一个主要未解决的问题是，是什么驱动了银屑病中性粒细胞NETosis潜能的增强，而警报素很可能是一个上游触发因素。由于中性粒细胞对DAMPs反应强烈，警报素提供了一个有趣但尚未充分研究的上游联系，连接中性粒细胞失调和上皮损伤。与免疫失调并行，氧化应激是银屑病病理生物学的另一个关键但了解甚少的特征。银屑病中报道了高水平的脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质氧化，以及由过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽介导的抗氧化机制减少。氧化应激不仅有助于角质形成细胞过度增殖和炎症细胞因子释放，而且是NETosis的关键介质。警报素失调、中性粒细胞活化和氧化还原失衡的综合效应表明银屑病中存在一个尚未完全阐明的前馈炎症循环。尽管对适应性免疫有许多见解，但我们对银屑病中驱动这些适应性免疫反应的先天免疫事件的理解仍然不完整。考虑到上述空白，本研究旨在明确NETs及其相关标志物（MPO–DNA复合物、CitH3、PAD4、NE和NADPH氧化酶活性）在外周血和皮损皮肤中的作用与警报素的关系。此外，评估了警报素预处理的NETs在活动期银屑病患者中引发炎症细胞因子反应（即IFN-γ、IL-6、IL-15、IL-17、TNF-α、IL-13、IL-23）和氧化应激标志物（即MDA、8-OHdG、SOD、GSH/GSSG、过氧化氢酶）的作用。这是首个确立警报素（IL-33/TSLP）在诱导NETs中作用及其后续触发银屑病患者外周血氧化应激和炎症的研究，证明了IL-33–TSLP–NETs三联轴参与银屑病发病机制的新机制。
2. 材料与方法
2.1. 研究受试者与采样
共有112名参与者从印度全印医学科学研究所（AIIMS）新德里皮肤科门诊部招募。患者组仅包括斑块型银屑病（即寻常型银屑病）患者。根据临床评估和影像学病史系统性地排除银屑病关节炎（PsA）个体。使用银屑病面积和严重程度指数（PASI）评估疾病严重程度。符合条件的患者为活动期银屑病，未接受过治疗，或在样本采集前四周内未接受过全身或局部治疗（包括皮质类固醇、维A酸、光疗、甲氨蝶呤、环孢素或生物制剂）。为尽量减少干扰变量，两组均排除以下情况：代谢综合征（如肥胖、血脂异常）、心血管疾病、自身免疫性疾病（自身免疫性甲状腺炎、类风湿关节炎（RA）、炎症性肠病（IBD）、系统性红斑狼疮（SLE））、相关皮肤疾病（白癜风、PsA、斑秃、痤疮、皮炎等）、全身感染、近期免疫治疗、吸烟、酗酒或任何药物成瘾，以及BMI ≥ 25。研究人群包括56名活动期银屑病患者（47名男性，9名女性）和56名年龄匹配的健康对照（39名男性，17名女性）。人口统计学详细信息见表1。从所有参与者收集血液样本，并从活动期银屑病患者的皮损皮肤获取3-4毫米皮肤活检组织。为进行比较，从接受疤痕修复或包皮环切术的健康受试者获取正常皮肤样本（n = 56）。所有患者和对照受试者在入组时均无任何相关的炎症、自身免疫或感染性疾病。获得所有参与者的书面知情同意。研究方案经AIIMS新德里机构伦理委员会批准，研究根据赫尔辛基人体研究宣言进行。
2.2. PBMC分离
从活动期银屑病患者和健康对照者采集外周血样本。使用Histopaque?-1077密度梯度离心法按照制造商说明分离PBMCs。小心吸出分离的PBMC层，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并重悬于含有10%胎牛血清（FBS）的完全RPMI-1640培养基中，用于后续分析。
2.3. 中性粒细胞分离、NET形成和刺激实验：鉴定与定量
使用两步法从活动期银屑病患者和健康对照者的外周血中分离中性粒细胞，该方法涉及基于Histopaque?-1119的密度梯度离心，随后进行Percoll梯度分离。分离的细胞用无菌1× PBS洗涤，并接种到含有13毫米圆形玻璃盖玻片的24孔培养板中，培养基为含有2% FBS的RPMI-1640培养基。在NET诱导前，通过多色流式细胞术评估中性粒细胞活力和纯度。然后将细胞以1 × 106细胞/mL/孔的浓度接种，并允许贴壁一小时。贴壁后，中性粒细胞接受三种不同处理：（i）佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA；600 nM）在37°C下作用4小时（PMA作为NET诱导的阳性对照，阴性对照中仅添加培养基），（ii）重组人IL-33（rhIL-33；100 ng/mL），和（iii）重组人TSLP（rhTSLP；100 ng/mL）在37°C下作用4小时。对rhIL-33和rhTSLP进行了剂量优化实验（0 ng/mL（仅培养基）、50 ng/mL和100 ng/mL）。根据结果，选择100 ng/mL的rhIL-33和rhTSLP浓度用于所有后续实验，因为在此剂量下观察到最大反应。随后，将rhIL-33和rhTSLP预处理的NETs用于刺激PBMCs 24小时，然后进行RNA提取和细胞裂解物制备，分别用于后续的qPCR分析和ELISA检测。此外，在类似的实验设置中，进行了实验以研究rhIL-33和rhTSLP对PBMCs的直接作用。所有实验均设三个复孔。在NET诱导前使用DAPI对照排除细胞外DNA的存在。对于定量分析，在接种时和接种后1小时（细胞贴壁后，刺激前）计数完整的中性粒细胞。从每个孔中取出玻璃盖玻片，进行免疫荧光研究。使用荧光显微镜图像分析评估NET形成。使用形态学特征评估排除凋亡/坏死细胞，以区分NETosis和NET特征（MPO–DNA复合物、去浓缩的细胞核、细胞外DNA/染色质）。仅满足形态学标准和MPO–DNA重叠的细胞被归类为NETotic细胞。NET评估依赖于结合形态学评估、MPO–DNA共定位和平均荧光强度的免疫荧光显微镜分析。
2.4. RNA提取和qPCR实验
使用RNA提取试剂盒从外周血、皮肤（皮损和非皮损）活检组织以及刺激后的PBMCs中提取总RNA。使用纳米滴分光光度计测量分离RNA的纯度和浓度。为消除任何残留的DNA污染，按照制造商说明使用DNase I处理RNA样品。对于cDNA合成，使用1 μg经DNase处理的RNA，通过iScript? cDNA合成试剂盒进行逆转录。所得cDNA用于qPCR分析。使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix在CFX96实时PCR系统上进行qPCR，遵循MIQE指南。遵循标准PCR设置，包括初始变性（95°C；10分钟），随后进行40个循环的变性（95°C；15秒）、在优化温度下退火（30秒）和最终延伸（72°C）。所有实验均设三个复孔，并使用β-肌动蛋白作为内参。使用平均Ct值进行分析，并针对β-肌动蛋白进行标准化。寡核苷酸引物从Sigma-Aldrich获得（表2）。基因表达数据以2?ΔCt值表示。
2.5. ELISA检测
使用ELISA法对银屑病患者和对照者的血清/细胞裂解物样品进行蛋白质定量/酶活性检测，包括MPO–DNA复合物、人CitH3、PAD4、NADPH氧化酶活性和NE活性。在单独的实验设置中，对从刺激的PBMCs获得的细胞裂解物中的氧化应激标志物进行定量。使用比色/荧光测定试剂盒评估氧化应激标志物，包括8-OHdG、MDA、SOD、过氧化氢酶活性和GSH/GSSG比值。所有检测均按照制造商说明进行。使用酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。为每个检测生成标准曲线，浓度根据特定检测单位表示。每个样品进行三次分析。
2.6. 流式细胞术检测
使用基于荧光流式细胞术原理的自动化Sysmex XN-1000血液分析仪估算全血中的中性粒细胞百分比。通过荧光标记的MPO抗体，使用BD FACSLyric?估算全血中的MPO+中性粒细胞，遵循标准方法。简要来说，100 μL EDTA抗凝全血用1× BD FACS?裂解缓冲液在室温下裂解10分钟，然后离心（400× g，5分钟）并用1× PBS洗涤。用4%多聚甲醛固定细胞20分钟（室温），洗涤并用BD Perm/Wash?缓冲液透化（30分钟，4°C）。透化细胞与FITC标记的抗人MPO抗体孵育（20分钟，4°C，避光），洗涤两次并重悬于PBS中。此外，在NET诱导前，通过多色流式细胞术评估中性粒细胞的活力和纯度。对于活力评估，新鲜分离的中性粒细胞用膜不通透的核酸染料SYTOX? Green染色，并立即在流式细胞仪上获取。对于纯度评估，中性粒细胞固定后用表面抗体（抗人CD16-PerCP.Cy5.5和抗人CD14-PECy7）染色，透化后进行细胞内染色（抗人MPO抗体）。然后在BD FACSLyric?上获取样品，每个样品记录十万个事件。使用FSC-A vs. FSC-H设门排除双联体，然后依次对粒细胞设门。使用未染色和同型对照设门，并使用BD? CompBeads进行补偿。使用BD FACSuite? v6.0分析数据，细胞频率以占总粒细胞的百分比表示。对于细胞活力，在单细胞粒细胞门内，SYTOX? Green阴性细胞被鉴定为活中性粒细胞，而SYTOX? Green阳性事件被视为非活细胞。对于纯度评估，中性粒细胞通过其特征性免疫表型（MPO+CD16hiCD14lo）定义，从而排除单核细胞和其他污染的白细胞群。在所有实验检测中，中性粒细胞活力保持在>99%，纯度>98%。
2.7. 免疫荧光研究
皮肤（皮损和正常皮肤）活检组织在4%多聚甲醛中固定，并在浓度递增的乙醇中脱水，然后石蜡包埋。将4 μm厚的切片置于多聚赖氨酸包被的载玻片上。脱蜡后的切片在浓度递减的乙醇中再水化，然后用1× PBS洗涤，随后在95°C的柠檬酸钠缓冲液（pH 6）中进行抗原修复20分钟。处理过的皮肤组织切片和刺激的中性粒细胞（在盖玻片上）用1× PBS洗涤，并用0.2% Triton-X透化，然后在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭45分钟。封闭后，切片/细胞与一抗（人抗MPO，小鼠多克隆，1:100）在4°C下孵育过夜。细胞/组织切片用含有0.025% Tween-20的1×PBS洗涤，然后与二抗（即FITC标记的山羊抗小鼠，1:1000）孵育1小时。然后洗涤组织切片/细胞，随后用DAPI孵育以复染细胞核。为防止光漂白，使用VECTASHIELD抗淬灭封片剂用盖玻片封片。使用尼康Ts2 Eclipse荧光显微镜获取图像。通过显示细胞外DNA（DAPI蓝色染色）与MPO（绿色）的共定位来定量NETotic细胞，这是NET形成的定义特征。计数DAPI阳性的完整细胞核，NET形成表示为显示NETotic形态的细胞数相对于接种中性粒细胞总数的比例，即NETs百分比 = （NETs数量 / 中性粒细胞总数）× 100）。荧光强度测量值针对每个显微镜视野的DAPI阳性中性粒细胞数量进行标准化，以校正细胞密度的变化。使用ImageJ（Fiji）软件处理获取的图像，以确保所有实验条件定量的标准化。简要来说，分离单个荧光通道并转换为8位灰度图像，然后进行背景扣除。应用自动阈值算法区分特异性信号和背景，并生成二值图像。基于去浓缩和扩展的DNA形态特征，结合细胞外定位和与MPO的共定位来识别NET结构。为排除小碎片和非特异性染色，在颗粒分析过程中应用面积阈值，仅包括超过预定最小面积的物体进行定量。NET形成表示为每个视野中NETotic细胞相对于细胞总数的百分比。每个样品分析三个独立的显微镜视野并取平均值，以最小化视野间变异性。
2.8. 统计分析
所有统计比较和图表均使用GraphPad Prism 5进行。使用D’Agostino–Pearson综合检验评估数据分布的正态性。对于正态分布（参数）数据集，两组间比较使用非配对双尾Student t检验（条形图显示均值±SEM）；对于非正态分布（非参数）数据集，应用Mann–Whitney U检验（表示为显示中位数（最小值-最大值）的箱线图/散点图）。对于涉及两个以上组的实验，使用单因素ANOVA（用于正态分布数据）和Kruskal–Wallis检验（用于非参数数据）。使用Pearson相关分析对正态分布变量进行相关性分析（Pearson相关系数在散点图中表示为‘r’）。为尽量减少多重检验产生的假阳性发现，在适用的情况下应用Bonferroni校正。在所有测量中，p值小于0.05（p < 0.05）设为具有统计学显著性。
3. 结果
本研究观察到，与对照组相比，活动期银屑病患者的循环中性粒细胞水平显著增加（p < 0.001）。然而，活动期银屑病患者和对照组之间MPO阳性中性粒细胞的百分比无显著差异（p = 0.178）。相关性分析显示，中性粒细胞频率与PASI评分呈显著正相关（r = 0.289, p = 0.041）。但MPO阳性中性粒细胞频率与PASI评分无显著相关性（r = –0.085, p = 0.554）。免疫荧光分析揭示了MPO蛋白在皮肤组织中的定位，与对照组相比，活动期银屑病患者皮损皮肤中观察到明显的MPO表达。平均荧光强度（MFI）的定量分析证实了这些观察结果，银屑病皮损皮肤中MPO的MFI值显著高于对照组（p < 0.001）。
接下来，我们测量了活动期银屑病患者和对照组外周血中NET相关蛋白和酶活性。观察到活动期银屑病患者血清中MPO–DNA复合物、PAD4和CitH3的水平显著升高（p < 0.001），反映了NET形成的增加。此外，NET相关酶活性，包括NE和NADPH氧化酶，在活动期银屑病患者中显著高于对照组（p < 0.001）。所有ELISA检测均进行三次，箱线图（Mann–Whitney U检验）表示中位数（最小值-最大值）。接下来，我们确定了NET形成能力，发现活动期银屑病患者中NETotic细胞（每MPO阳性中性粒细胞）显著增加（p < 0.001），平均荧光定量结果也支持这一发现（p < 0.001）。
外周血全血中警报素基因的转录谱分析显示，与对照组相比，活动期银屑病患者中所有研究的警报素，如IL-33（p = 0.002）、TSLP（p = 0.001）、S100A7（p = 0.043）和HSP70（p = 0.048）的表达显著增加，但S100B（p = 0.096）和HSP60（p = 0.703）除外。然而，皮肤 compartment中相应的转录表达显示，与正常皮肤相比，银屑病皮损皮肤中IL-33（p = 0.001）、TSLP（p = 0.001）、S100A7（p = 0.012）、HSP60（p = 0.01）和HSP70（p = 0.044）的表达升高，但两组中S100B无显著差异。警报素IL-33和TSLP在皮肤和血液 compartment中 consistently表现出 elevated expression。考虑到警报素在银屑病中的关键作用，我们接下来确定了两个目标警报素IL-33和TSLP在NET形成中的作用及其在细胞因子产生和氧化应激中的后续作用。
对IL-33和TSLP进行了剂量依赖性实验（0 ng/mL（仅培养基）、50 ng/mL和100 ng/mL，作用4小时），结果显示在100 ng/mL时反应最大，后续实验均在100 ng/mL浓度下进行。与对照组相比，来自活动期银屑病患者的分离中性粒细胞在rhIL-33或rhTSLP刺激下表现出增强的NET形成能力，定量数据进一步支持了这一结果（p < 0.001）。同样，银屑病患者IL-33和TSLP诱导的NETs中MPO平均荧光强度（MFI）显著高于对照组。
由于这些警报素已知由角质形成细胞分泌，它们可能作为皮肤中诱导NETs的可能触发因素，并可能进一步加剧皮肤中的炎症反应。为确定警报素预处理的NETs是否能调节氧化应激标志物，如氧化DNA损伤（8-OHdG）、脂质过氧化（MDA）、GSH/GSSG比值和抗氧化酶活性（SOD和过氧化氢酶），测定了用rhIL-33和rhTSLP预处理的NETs刺激的PBMCs中这些标志物的状态。用rhIL-33预处理的NETs刺激的PBMCs显示，与对照组相比，活动期银屑病患者的8-OHdG（p = 0.001）和MDA（p = 0.041）水平显著升高。此外，活动期银屑病患者的抗氧化能力降低，表现为较低的SOD活性（p = 0.002）、过氧化氢酶活性（p = 0.01）和GSH/GSSG比值（p = 0.008）。对于用rhTSLP预处理的NETs刺激的PBMCs观察到类似趋势，其中8-OHdG（p =
