《Journal of Inflammation Research》：Identification of PANoptosis-Related Biomarkers in Hypertrophic Cardiomyopathy: Insights from Multi-Omics Analysis
摘要
背景
肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM)是一种常见的遗传性心肌病，以心室肥厚、纤维化和心源性猝死风险增加为特征。然而，其进展所涉及的潜在分子通路尚未完全明确。PANoptosis是一种新定义的炎症性程序性细胞死亡形式，整合了细胞焦亡(pyroptosis)、凋亡(apoptosis)和坏死性凋亡(necroptosis)，已被证实与心脏损伤相关，并可能作为连接炎症和心肌重塑的汇聚机制，但在HCM中尚未得到研究。
方法
分析HCM和对照心脏的转录组谱，以鉴定差异表达的PANoptosis相关基因。采用综合多算法机器学习框架（整合了集成学习、基于核的方法和正则化回归模型）构建了一个九基因诊断面板，并在外部队列中进行了验证。通过共识聚类鉴定分子亚型。评估了免疫浸润、功能富集和ceRNA调控网络。单核RNA测序(single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq)将基因表达定位到特定的心脏细胞类型。细胞-细胞通讯分析探索了细胞间信号。在小鼠HCM模型中通过超声心动图、组织学和RT-qPCR进行了实验验证。应用分子对接评估候选化合物的治疗潜力。
结果
九个PANoptosis相关基因（S100A9, GADD45A, IER3, STAT3, SFRP1, PHLDA1, JAK2, MYC, S100A8）显示出高诊断性能（AUC > 0.95）。鉴定出两种具有不同免疫和代谢特征的分子亚型。PANoptosis基因与T细胞、巨噬细胞和树突状细胞相关。CellChat分析揭示了心肌细胞和成纤维细胞之间PDGF介导的信号传导。关键基因表现出细胞类型特异性的表达。体内验证证实了基因表达趋势。此外，叶酸(Folic Acid)和维A酸(Tretinoin)与核心靶点表现出良好的对接亲和力，提示潜在的治疗相关性。
结论
本研究首次提供了将PANoptosis与HCM分子发病机制联系起来系统证据。PANoptosis促进了HCM的发病机制和免疫重塑，所鉴定的生物标志物显示出作为诊断指标和治疗靶点的转化潜力。整合分析揭示了新的PANoptotic信号轴，可能为未来HCM的精准诊断和干预策略提供指导。
引言
肥厚型心肌病(HCM)是最常见的遗传性心血管疾病，全球患病率约为1/200。其临床特征包括不对称性左心室肥厚、心肌细胞排列紊乱和间质纤维化，常伴有舒张功能障碍、心律失常和心源性猝死风险升高。虽然肌节基因如MYH7、MYBPC3和TNNT2的突变已被确认为致病原因，但突变携带者间显著的表型异质性提示其他分子机制参与了疾病进展。最近研究还发现桥粒基因变异，特别是desmoplakin (DSP)，是非典型或致心律失常性HCM的新兴贡献者。除基因型-表型关系外，仍需动态分子指标来捕捉活跃的疾病生物学信息并指导临床决策。
近期研究强调了炎症和调节性细胞死亡途径在HCM相关心脏重塑中的关键作用。PANoptosis是一种新表征的炎症性程序性细胞死亡方式，整合了焦亡、凋亡和坏死性凋亡的特征，已成为一系列病理状况（包括感染性疾病、恶性肿瘤和自身炎症综合征）的核心机制。PANoptosis通过称为PANoptosome的多蛋白复合物执行，已知能放大细胞因子释放并加剧组织损伤。在机制上，PANoptosis不同于单一路径的死亡程序，它在一个调控支架内协调caspase依赖性凋亡信号、gasdermin介导的焦亡孔形成和RIPK驱动的坏死性凋亡执行，从而实现炎症放大和交叉对话，这是任何单一途径无法解释的。虽然PANoptosis在心血管领域（如动脉粥样硬化中巨噬细胞介导的斑块不稳定性、缺血诱导的线粒体应激下的血管平滑肌细胞功能障碍、急性心肌梗死中的心肌细胞死亡）作为关键的炎症细胞死亡途径日益受到认可，但它在HCM中的作用仍 largely unexplored，并且迄今为止尚未有系统地鉴定与该途径相关的诊断标志物。
鉴于HCM的临床负担以及当前遗传标志物在捕捉疾病活动性方面的局限性，日益需要识别与炎症信号和细胞死亡相关的动态分子特征。越来越多的证据将免疫激活和持续性炎症与HCM中的心肌纤维化和不良重塑联系起来，表明其作用可能超越继发性反应。值得注意的是，白细胞介素-1β (IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平升高与疾病严重程度和不良预后相关，这支持了PANoptotic信号可能参与HCM发病机制的假说。在此背景下，针对PANoptosis的生物标志物发现对于临床风险分层（例如，识别炎症主导表型）、早期诊断以及为患者优先选择免疫炎症或抗纤维化干预措施具有潜在的转化效用。
材料与方法
数据来源
从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库检索基因表达数据集GSE141910、GSE36961、GSE160997、GSE180313和GSE32453。为减少批次效应，将数据集GSE141910和GSE36961合并，并使用R中的“sva”包进行校正。该合并数据集包括197个对照样本和137个HCM样本，作为主要训练集。数据集GSE160997（对照=5，HCM=19）、GSE180313（对照=8，HCM=14）和GSE32453（对照=5，HCM=8）用作独立验证队列。
差异表达分析及与PANoptosis相关基因的交集
使用limma包识别差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)，标准为错误发现率(False Discovery Rate, FDR) < 0.05且|log2FC| ≥ 0.5。将鉴定出的DEGs与从已发表文献和数据库中获取的PANoptosis相关基因列表进行交集，以识别HCM中失调的PANoptosis关键基因。
GO和KEGG功能富集分析
使用ClusterProfiler R包对PANoptosis相关交集基因集进行Gene Ontology (GO)富集分析，涵盖生物过程、细胞组分和分子功能三个类别。同时进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)通路富集分析。显著性阈值设为经Benjamini-Hochberg校正后的调整p值(p.adjust) < 0.05。
机器学习模型构建与诊断基因选择
构建了总共101种机器学习模型组合，使用了包括随机森林(Random Forest, RF)、极限梯度提升(Extreme Gradient Boosting, XGBoost)、glmBoost、支持向量机(Support Vector Machines, SVM)以及正则化技术如LASSO、岭回归和弹性网络等算法管道。在训练集内使用分层10折交叉验证进行超参数调优。使用受试者工作特征曲线下面积(Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve, AUC)评估模型在训练集和三个外部验证数据集上的性能。
共识聚类分析
基于PANoptosis相关基因的表达谱，使用“ConsensusClusterPlus” R包进行共识聚类分析，以识别分子亚型。根据累积分布函数(Cumulative Distribution Function, CDF)曲线、delta面积图和共识热图确定最佳聚类数(k)。
免疫浸润相关性分析
将表达谱与免疫浸润评分整合，系统评估其与核心基因的相关性。使用CIBERSORT和MCPcounter算法量化免疫浸润。计算Spearman相关系数。
单核转录组分析和基因定位
分析来自Broad研究所Single Cell Portal（项目ID: SCP1303）的公开可用已处理单核RNA测序(snRNA-seq)数据。使用Seurat R包进行分析。细胞类型注释基于经典标记基因，并使用SingleR包和Human Primary Cell Atlas参考进行验证。
细胞-细胞通讯分析
使用CellChatDB.human数据库构建CellChat对象，以识别潜在的配体-受体对并估计细胞间通讯概率。
动物实验
使用8周龄雄性C57BL/6小鼠。通过横向主动脉缩窄(Transverse Aortic Constriction, TAC)手术诱导HCM模型。假手术对照组除省略主动脉结扎外，手术过程相同。术后四周进行超声心动图评估，随后处死小鼠，收集心脏组织用于组织学染色和RT-qPCR分析。
结果
鉴定HCM患者中与PANoptosis相关的差异表达基因和功能富集
整合两个基因表达数据集GSE141910和GSE36961并进行批次效应校正后，差异表达分析显示HCM和对照心肌组织之间存在明显区分。火山图展示了上调和下调的DEGs。将HCM相关DEGs与PANoptosis基因集取交集，鉴定出30个重叠基因，占全部DEGs的2.8%。GO和KEGG通路富集分析显示，这些基因在JAK-STAT信号通路、IL-17信号、AGE-RAGE信号和Th17细胞分化等通路中显著富集，这些通路在心脏纤维化、免疫激活和细胞凋亡过程中具有已知作用。
机器学习模型构建与评估
综合机器学习方法测试了81种建模策略。其中，随机森林(RF)模型在所有数据集中表现出最高且最一致的诊断性能：在训练集、GSE160997和GSE180313队列中AUC = 1.000，在GSE32453中AUC = 0.975。特征选择确定了九个关键基因：S100A9、S100A8、MYC、JAK2、SFRP1、GADD45A、STAT3、PHLDA1和IER3，这些基因在炎症、凋亡和心肌损伤中具有已知作用。
鉴定HCM患者中两种PANoptosis相关亚型
基于PANoptosis相关诊断基因的表达谱进行无监督共识聚类，确定了两个分子亚型。主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)证实了两个簇之间的转录异质性。热图显示簇特异性基因表达模式。几个炎症和应激相关基因在C2亚型中高表达，而代谢和细胞周期相关基因在C1亚型中富集。关键PANoptosis相关诊断基因在C2中显著上调。基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis, GSVA)显示，C2亚型在免疫和炎症相关通路中显著富集，而C1亚型则显示凋亡调节、巨噬细胞分化等通路活性增加。KEGG分析进一步揭示C2亚型与I型糖尿病、移植物抗宿主病、病毒性心肌炎等同种异体移植排斥相关的通路上调，反映了免疫激活增强。
PANoptosis相关诊断基因的验证
基于九个候选基因构建了列线图(Nomogram)模型。校准分析显示预测结果与观察结果之间具有良好的一致性。决策曲线分析(Decision Curve Analysis, DCA)证实了在广泛阈值范围内具有良好的净临床效益。在三个独立数据集的外部验证中显示出一致的诊断准确性。小提琴图显示GADD45A、IER3、PHLDA1和S100A8等基因在HCM患者中的表达水平在所有数据集中均显著升高。
在HCM小鼠模型中验证九个核心PANoptosis相关标志物
通过TAC手术建立小鼠HCM模型。组织学染色（HE和Masson三色染色）证实了心肌细胞肥大、结构紊乱和间质纤维增加等典型病理特征。超声心动图显示HCM组左心室功能障碍显著，表现为IVSd、IVSs、LV mass增加以及LVEF和LVFS显著降低。RT-qPCR分析显示，与假手术组相比，HCM组左心室组织中PHLDA1、IER3、JAK2、GADD45A和S100A8显著上调，而S100A9、STAT3、MYC和SFRP1显著下调。
PANoptosis相关基因的免疫相关性
免疫相关性分析揭示了九个PANoptosis相关诊断基因之间不同的免疫学模式。例如，IER3与γδ T细胞和滤泡辅助T细胞呈正相关，与M0巨噬细胞和静息NK细胞呈负相关。GADD45A与活化的树突状细胞和NK细胞呈中度正相关。JAK2与浆细胞和记忆CD4+ T细胞呈正相关，与单核细胞和M0巨噬细胞呈负相关。MYC与单核细胞、活化的树突状细胞和滤泡辅助T细胞相关，而与Tregs和浆细胞负相关。这些关联与HCM中的免疫炎症环境一致。
单核转录组谱分析揭示HCM中异常的细胞间信号模式
snRNA-seq数据的t-SNE投影显示了HCM和正常供体(NF)心肌核之间的明显转录分离。注释确定了七种主要细胞群。特征图展示了九个PANoptosis相关诊断基因在细胞群中的空间分布。值得注意的是，GADD45A、S100A9和STAT3在成纤维细胞和巨噬细胞中富集，而IER3、PHLDA1和S100A8表现出更广泛的表达模式。
细胞通讯分析显示，心肌细胞是主要的信号发送者，向包括成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞在内的多个细胞群体传递PDGF信号。进一步分析表明，成纤维细胞是PDGF信号的主要接收者。气泡图突出显示PDGFC-PDGFRA是最显著的配体-受体对，主要富集在心细胞-成纤维细胞轴上。表达谱分析表明PDGFC主要在心肌细胞中表达，PDGFRA在成纤维细胞中高表达。
讨论
本研究首次提供了多模态证据表明PANoptosis在HCM中具有转录活性和生物学相关性。通过整合转录组学、多算法机器学习和外部验证，鉴定出一个强大的9基因诊断特征。这些基因作为连接凋亡、焦亡和坏死性凋亡的汇聚节点。动物实验验证了基因表达趋势。研究发现揭示了HCM的分子异质性，并提示PANoptosis可能通过炎症放大和细胞间对话驱动心肌重塑。单核RNA测序和细胞通讯分析进一步揭示了潜在的心肌细胞-成纤维细胞PDGF信号轴。计算预测的ceRNA网络和分子对接为上游调控和潜在治疗干预提供了线索。
研究的局限性包括依赖公共数据集的异质性、横断面设计、动物模型与遗传性HCM的差异以及缺乏蛋白质水平和功能性验证。未来的研究需要整合蛋白质组学、空间分析和功能实验，以建立因果关系并评估PANoptosis导向干预措施的临床效用。
结论
本研究提供了将PANoptosis与HCM发病机制联系起来的多维证据。所鉴定的基因特征和细胞通讯机制为HCM的精准诊断和靶向治疗提供了新的分子见解和候选靶点。然而，这些结果应被视为假设生成。需要进一步的研究来确立其因果关系并评估临床效用。总体而言，本研究强调了在HCM中，一个相互关联的细胞死亡-免疫-纤维化网络的协调激活，其中PANoptosis作为连接炎症应激、成纤维细胞活化和不良重塑的机制枢纽。
