《Biomolecules》：Identification and Functional Analysis of tgfb2b Gene in Ovarian Development of Chinese Tongue Sole (Cynoglossus semilaevis)
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本研究首次系统揭示了半滑舌鳎tgfb2b基因在卵巢分化发育中的关键作用。通过表达谱分析发现该基因在卵巢中特异性高表达，并随发育进程持续上调。实验证实转录因子C/EBPα和c-Jun可抑制其启动子活性，而新型miRNA novel-m0083-3p能直接靶向调控该基因。功能研究表明tgfb2b通过调控smad1/2和foxl2-esr2b通路参与性腺发育，为硬骨鱼类性别决定网络提供了新视角。
1. 引言
作为具有雌性异型ZW性别决定系统的经济鱼类，半滑舌鳎表现出显著的性别二态性——雌鱼比雄鱼晚熟但体型大2-4倍。养殖群体中雄鱼比例过高会导致巨大经济损失，因此解析雌性性别形成的分子机制对水产养殖可持续发展具有重要意义。研究表明TGF-β超家族成员在硬骨鱼类性别决定与分化中起关键作用，但tgfb2b在性腺发育中的具体功能尚不明确。
2. 材料与方法
实验采用海阳育种基地培育的半滑舌鳎，通过qPCR检测tgfb2b在6种组织及4个发育时期（3月龄至1.5龄）性腺中的表达谱。利用原位杂交技术定位基因在性腺细胞中的分布，采用双荧光素酶报告系统分析启动子活性及转录调控，通过siRNA干扰技术验证基因功能，并利用双荧光素酶系统验证miRNA与靶基因的调控关系。
3. 结果
3.1 序列特征分析
tgfb2b基因CDS区长1266 bp，编码421个氨基酸，包含TGF-β前肽区域（27-234位）和TGF-β结构域（322-420位），具有8个保守半胱氨酸残基。系统进化分析显示TGFB2b与青鳉、斑点叉尾鮰同源序列聚为一支，表达热图揭示其在雌鱼性腺中特异性高表达。
3.2 表达模式与细胞定位
qPCR结果显示tgfb2b在卵巢中表达量显著高于精巢，在脑和肌肉中呈雌性偏倚表达。发育时期表达谱显示该基因在3月龄至1.5龄卵巢中持续上调，而在精巢中始终维持低水平。原位杂交证实基因信号分布于I-III时相卵母细胞，精巢中几乎无表达。
3.3 启动子转录调控
双荧光素酶检测发现tgfb2b启动子具有显著转录活性（较空载体提高1.24倍）。转录因子C/EBPα和c-Jun可抑制启动子活性，结合位点突变后抑制效应消失。
3.4 基因敲低效应
siRNA3干扰使tgfb2b表达降至对照组的59%，同时导致下游基因smad1、smad2及性别相关基因foxl2、esr2b显著下调。
3.5 miRNA靶向调控
新型miRNA novel-m0083-3p在雌雄性腺中呈现与tgfb2b相反的表达模式。双荧光素酶验证显示该miRNA可通过结合3'-UTR直接抑制tgfb2b表达，结合位点突变后抑制效应消失。
4. 讨论
本研究首次证实tgfb2b在半滑舌鳎卵巢发育中的核心作用。其时空表达模式提示该基因参与从性腺分化到成熟的全过程。转录因子C/EBPα和c-Jun的抑制作用可能构成精细调控网络，而novel-m0083-3p的靶向调控揭示了转录后调控机制。基因敲低引起的foxl2-esr2b通路下调表明tgfb2b可能通过TGF-β/SMAD信号通路与经典卵巢分化轴系相互作用。这些发现为阐明硬骨鱼类性别决定网络提供了新依据。
5. 结论
tgfb2b作为卵巢特异性表达基因，通过转录调控、miRNA靶向和信号通路交叉对话等多层次机制，在半滑舌鳎卵巢分化发育中发挥重要作用。后续应聚焦该基因与foxl2-cyp19a-esr轴的互作机制，以完善鱼类性别调控网络理论。
