《Current Issues in Molecular Biology》：Eryptosis in Acute Patients: A Hypothesis on Its Potential Clinical Impact and Current Gaps in Evidence
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本研究首次通过多组学整合策略揭示天然吲哚生物碱Gramine（GR）通过调控“CYP4A22-AS1/LINC00958–hsa-miR-133b–CDK2”竞争性内源RNA（ceRNA）轴，抑制HeLa细胞增殖迁移、诱导细胞周期G0/G1期阻滞和凋亡。研究发现CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶2）是关键靶点，且其与免疫检查点分子CD47显著正相关，为GR作为宫颈癌（CC）靶向免疫联合治疗候选药物提供了理论依据。
Gramine对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用
研究通过CCK-8实验证实，Gramine（GR）以剂量依赖方式显著抑制HeLa细胞活力，半抑制浓度（IC50）为120 μg/mL。划痕实验显示GR处理组细胞迁移率降低9.53%，且细胞形态呈现边界模糊、变圆收缩。流式细胞术检测表明GR可促进细胞早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡率上升；细胞周期分析发现GR使S期和G2/M期细胞比例分别下降约9.76%和2.57%，G0/G1期细胞显著增加12.32%。这些结果证明GR能有效抑制宫颈癌细胞增殖迁移、诱导凋亡和G0/G1期阻滞。
GR作用靶点的筛选与功能富集分析
通过整合TCMSP、PharmMapper等数据库获得99个GR潜在靶点，结合DisGeNET、GeneCards等数据库和GSE63514数据集差异表达基因筛选出1726个宫颈癌相关靶点，取交集后得到22个共同靶点。Gene Ontology（GO）富集分析显示这些靶点主要参与氧水平应答、缺氧反应等生物过程，定位于膜筏、膜微域等细胞组分，具有蛋白激酶活性等分子功能。KEGG通路分析提示靶点显著富集于蛋白聚糖癌症通路、巨细胞病毒感染和人乳头瘤病毒（HPV）感染通路。
CDK2作为GR抗宫颈癌关键靶点的验证
构建蛋白互作（PPI）网络并通过CytoHubba插件计算介数、紧密度和度中心性排名前10的靶点，取并集获得TNF、CDK2等12个核心靶点。随机森林算法进一步识别TNF、CDK2和DPP4为重要性前三的候选基因。ROC曲线显示CDK2的AUC值达0.944。单细胞转录组数据分析表明CDK2在宫颈癌上皮细胞中表达上调，GEPIA2和GSE63514数据集批量转录组验证其mRNA水平升高，HPA数据库免疫组化证实CDK2蛋白在癌组织中表达增强。分子对接显示GR与CDK2结合能为-6.5 kcal/mol，显著优于TNF（-4.9 kcal/mol）和DPP4（-4.7 kcal/mol）。实验验证GR处理后可显著降低CDK2的mRNA和蛋白表达，从而确定CDK2为GR的关键作用靶点。
CDK2上游ceRNA调控网络的构建与机制阐释
通过StarBase等数据库预测靶向CDK2的miRNA，与TCGA-CESC数据集差异表达miRNA取交集，发现hsa-miR-133b在宫颈癌中下调且高表达患者预后较好。GR处理后HeLa细胞中hsa-miR-133b表达显著上升。进一步预测并筛选与hsa-miR-133b相互作用的lncRNA，获得CYP4A22-AS1、LINC00958等7个与预后相关的lncRNA，其中CYP4A22-AS1和LINC00958高表达预示预后不良。GR处理可明显抑制这两种lncRNA的表达。相关性分析显示hsa-miR-133b与CDK2负相关，而lncRNA与CDK2正相关，由此构建“CYP4A22-AS1/LINC00958–hsa-miR-133b–CDK2”ceRNA调控轴，阐明GR可能通过解除lncRNA对hsa-miR-133b的海绵吸附作用，增强其对CDK2的抑制，从而抑制肿瘤进展。
关键分子的免疫浸润特征分析
免疫检查点相关分析显示，CDK2与CD47、CD276、NCR3LG1等显著正相关；免疫浸润分析提示CDK2高表达与肿瘤纯度、癌症相关成纤维细胞（CAF）浸润正相关，与免疫评分、NK细胞、记忆B细胞等负相关。类似地，CYP4A22-AS1和LINC00958也与CD47呈强正相关，且分别与静止CD4+记忆T细胞、CAF浸润正相关，与免疫细胞活性负相关。这表明CDK2、CYP4A22-AS1和LINC00958共同塑造免疫抑制微环境，可能通过调节CD47等检查点分子促进免疫逃逸。
讨论与结论
本研究系统阐明了GR通过ceRNA机制靶向CDK2抑制宫颈癌恶性表型的分子通路，并揭示其关键分子在免疫调节中的协同作用。GR下调CDK2及相关lncRNA表达，可能同时抑制肿瘤增殖并逆转免疫抑制状态，为开发GR作为宫颈癌靶向治疗和免疫联合策略提供了新颖的理论基础。
