《Bioactive Materials》：Bioengineered extracellular vesicles escape lysosomal degradation and deliver Tet-PKM2 for macrophage immunometabolic reprogramming and periodontitis treatment
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本研究针对牙周炎等慢性炎症疾病中巨噬细胞代谢失调的难题，开发了一种新型生物工程化大细胞外囊泡（LEVsTet-PKM2@TA），该囊泡能够有效逃逸溶酶体降解，将高活性代谢酶四聚体丙酮酸激酶M2（Tet-PKM2）靶向递送至巨噬细胞胞浆，成功逆转了脂多糖（LPS）激活巨噬细胞的异常丙酮酸代谢，增强了三羧酸循环（TCA）活性和线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），从而促使促炎性巨噬细胞向M2表型复极化，最终在小鼠牙周炎模型中实现了显著的牙周组织再生。该研究为通过免疫代谢重编程治疗慢性炎症疾病提供了创新性策略。
牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病，其主要特征是牙周支持组织的进行性破坏。长期以来，人们认为细菌感染是导致牙周组织破坏的直接原因，但越来越多的证据表明，宿主对微生物的免疫反应失调在疾病进程中扮演了更为关键的角色。作为先天免疫的核心效应细胞，巨噬细胞在宿主防御和炎症消退中功能多样。然而，在牙周炎发病过程中，巨噬细胞的极化状态发生显著偏移：促炎的M1型巨噬细胞过度活化并大量浸润组织，而抗炎的M2型巨噬细胞则受到抑制。这种失衡的免疫状态阻碍了组织稳态的恢复，并加剧了炎症性组织破坏。
近年来的研究发现，免疫代谢重编程是调控巨噬细胞极化和功能的一个基本机制。M1巨噬细胞表现出糖酵解代谢增强，同时三羧酸循环活性和线粒体氧化磷酸化受损，这使得它们能够对各种促炎刺激做出快速反应。相反，M2巨噬细胞则以完整的三羧酸循环和增强的氧化磷酸化为特征，这有助于抗炎细胞因子的产生。因此，促使巨噬细胞的代谢从糖酵解向三羧酸循环和氧化磷酸化转变，被认为是其从M1表型向M2表型转换的标志。尽管小分子药物或代谢中间物为巨噬细胞的代谢重编程提供了有前景的治疗范式，但它们的应用常因脱靶效应、潜在生物安全性问题以及因溶酶体降解导致的低生物利用度而受限。
丙酮酸激酶是糖酵解的最后一步限速酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，从而为三羧酸循环提供燃料。在巨噬细胞中，主要表达的丙酮酸激酶亚型是丙酮酸激酶M2，其通过改变构象状态来协调代谢重编程。其中，四聚体形式的PKM2具有高活性的代谢酶活性，可以促进葡萄糖来源的碳通量进入三羧酸循环和氧化磷酸化。然而，在炎症反应中，Tet-PKM2的表达会急剧下降，这使其成为开发新疗法的潜在免疫代谢靶点。
基于细胞外囊泡的载体系统在疾病治疗中引起了广泛兴趣。细胞外囊泡是纳米级的磷脂双分子层封闭结构，被广泛用作递送载体，将蛋白质、脂质和核酸等生物活性货物运输至受体细胞。由于其固有的对巨噬细胞的靶向特异性，以及高通用性、低免疫原性和良好的安全性等优势，细胞外囊泡代表了一个通过靶向递送生物活性剂来调节巨噬细胞极化和效应功能的有前景的平台。与小型细胞外囊泡相比，大细胞外囊泡具有更大的货物容量，赋予其更强的临床转化治疗潜力。然而，大多数细胞外囊泡及其携带的货物会被内吞并在溶酶体中降解，导致治疗效果下降。因此，对细胞外囊泡进行工程化改造，使其具备溶酶体逃逸能力，对于提高其治疗性能至关重要。
为了应对上述挑战，本研究团队在《Bioactive Materials》上发表了一项创新性研究。研究人员旨在构建一种富含Tet-PKM2、且具备溶酶体逃逸能力的大细胞外囊泡，以确保Tet-PKM2能够被成功递送至巨噬细胞胞浆，从而调控巨噬细胞的代谢重编程。
为开展此项研究，研究人员运用了几个关键技术方法。首先，他们通过慢病毒转导和TEPP-46（一种PKM2变构激活剂）处理，从人胚胎肾细胞中成功制备了富含Tet-PKM2的大细胞外囊泡。其次，利用单宁酸对大细胞外囊泡进行表面修饰，赋予其pH响应性的溶酶体逃逸能力，并通过粗粒化分子动力学模拟、共定位分析和钙黄绿素泄漏实验等验证了其逃逸效果。研究还使用了来自健康捐赠者和牙周炎患者的人牙龈组织样本以及小鼠结扎诱导牙周炎模型，通过靶向代谢组学、海马能量代谢分析、免疫荧光、Western blot、酶联免疫吸附测定、micro-CT和组织学分析等技术，系统评估了工程化囊泡在体外和体内对巨噬细胞免疫代谢、极化状态及牙周组织再生的影响。
3.1. 牙周炎牙龈组织中的代谢活性和Tet-PKM2表达变化
研究人员首先比较了健康捐赠者和牙周炎患者的牙龈组织代谢状态。靶向能量代谢组学分析显示，牙周炎牙龈组织存在显著的代谢紊乱，具体表现为糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸和乳酸水平显著升高，同时三羧酸循环中间产物富马酸和苹果酸积累，提示糖酵解通量增强而三羧酸循环功能受损。进一步通过免疫荧光、qRT-PCR和DSS交联Western blot分析发现，尽管牙周炎组织中总PKM2的表达升高，但其活性形式——Tet-PKM2的表达却显著降低。免疫电镜结果直观地显示，牙周炎患者牙龈组织巨噬细胞胞浆中的PKM2免疫反应性颗粒减少。体外实验也证实，LPS刺激巨噬细胞同样会导致Tet-PKM2表达下降。这些结果表明，Tet-PKM2的表达降低与牙周炎中的代谢功能障碍密切相关。
3.2. TEPP-46处理导致细胞内丰富的Tet-PKM2表达并促进产生富含Tet-PKM2的LEVs
为了获得富含Tet-PKM2的细胞外囊泡，研究团队通过慢病毒转导在HEK293T细胞中过表达PKM2，并使用TEPP-46进行变构激活，成功获得了高表达Tet-PKM2的细胞。随后，通过差速离心法分别分离了小型细胞外囊泡和大细胞外囊泡。表征结果显示，与小型细胞外囊泡相比，大细胞外囊泡中Tet-PKM2的富集程度更高，且TEPP-46处理能进一步增加其Tet-PKM2含量。这表明从经过基因工程和药理学处理的细胞中分离大细胞外囊泡，是获取高活性Tet-PKM2递送载体的有效策略。
3.3. 通过原位TA修饰的生物工程化LEVs@TA在巨噬细胞摄取后表现出强大的溶酶体逃逸能力
为了提高递送效率，研究人员利用单宁酸对大细胞外囊泡进行表面修饰。流式细胞术和荧光显微镜观察证实单宁酸能成功组装到大细胞外囊泡膜上。粗粒化分子动力学模拟显示，修饰后的大细胞外囊泡在被巨噬细胞内吞过程中能保持结构完整性。更重要的是，在酸性溶酶体环境下，单宁酸会从囊泡表面解离。通过溶酶体共定位分析和钙黄绿素泄漏实验，证实了单宁酸修饰显著降低了大细胞外囊泡与溶酶体的共定位，并有效破坏了溶酶体膜的稳定性，从而促进了囊泡的胞浆递送。透射电镜观察也直观显示了单宁酸修饰组巨噬细胞中溶酶体出现肿胀和膜破裂。
3.4. 生物工程化LEVs< />@TA递送Tet-PKM2实现巨噬细胞代谢重编程
体外功能实验表明，LEVsTet-PKM2@TA能够被LPS激活的巨噬细胞有效摄取，且无明显的细胞毒性。靶向代谢组学分析显示，LEVsTet-PKM2@TA处理显著降低了糖酵解中间产物2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸的水平，同时增加了三羧酸循环终产物GTP和ATP的产量，表明丙酮酸代谢流向得到了重编程。海马能量代谢分析进一步证实，LEVsTet-PKM2@TA处理不仅增强了巨噬细胞的糖酵解能力，更重要的是显著提高了其基础呼吸、最大呼吸能力和ATP产量。此外，该处理还恢复了线粒体膜电位，增加了细胞内ATP浓度。当使用线粒体丙酮酸载体1抑制剂UK-5099阻断丙酮酸进入三羧酸循环时，LEVsTet-PKM2@TA诱导的代谢重编程效应被逆转，证明其作用依赖于Tet-PKM2促进的丙酮酸流入三羧酸循环。
3.5. 生物工程化LEVs< />@TA通过代谢重编程促使巨噬细胞极化
代谢状态的改变直接影响了巨噬细胞的功能。qRT-PCR、ELISA和免疫荧光染色结果一致表明，LEVsTet-PPKM2@TA处理能显著降低LPS激活巨噬细胞中M1型相关标志物和细胞因子的表达，同时上调M2型相关标志物和细胞因子的表达。Western blot分析还发现，该处理抑制了LPS诱导的Hif-1α表达。这些结果证明，通过递送Tet-PKM2纠正代谢异常，能够有效促使促炎性M1巨噬细胞向抗炎性M2表型复极化。
3.6. 施用LEVs< />@TA可对抗小鼠牙周炎并促进炎症消退
在小鼠结扎诱导牙周炎模型中，局部注射LEVsTet-PKM2@TA显示出良好的生物相容性，未引起主要器官的病理改变或血清生化指标异常。Micro-CT扫描和三维重建结果显示，与PBS对照组相比，LEVsTet-PKM2@TA治疗组牙槽骨吸收显著减少，骨体积分数增加，骨小梁数量增多、分离度降低。组织学染色进一步证实，该治疗组牙龈组织中免疫细胞浸润明显减轻，胶原纤维排列更有序，表明牙周组织炎症得到有效缓解，修复过程增强。
3.7. LEVs< />@TA调节体内巨噬细胞表型和功能以促进组织修复
机制探讨发现，LEVsTet-PKM2@TA能够被牙周组织中的CD68阳性巨噬细胞有效摄取。免疫荧光分析显示，治疗组牙龈组织中M1型巨噬细胞比例显著下降，而M2型巨噬细胞比例显著上升。同时，治疗组牙龈组织的丙酮酸激酶活性明显升高，巨噬细胞核内Hif-1α和PKM2的表达减少。这表明LEVsTet-PKM2@TA通过递送具有酶活性的Tet-PKM2，在体内成功调节了巨噬细胞的代谢状态和极化方向，从而创造了有利于组织修复的微环境。
综上所述，该研究成功开发了一种新型的生物工程化大细胞外囊泡递送系统。该系统的创新性在于巧妙地将富含高活性代谢酶Tet-PKM2的大细胞外囊泡与具有溶酶体逃逸能力的单宁酸修饰相结合，实现了对巨噬细胞代谢状态的精准调控。研究不仅揭示了Tet-PKM2在牙周炎免疫代谢失调中的关键作用，更重要的是提供了一种通过“代谢干预”来治疗慢性炎症性疾病的新范式。该策略有效地将巨噬细胞从促炎状态重编程为抗炎/修复状态，最终促进了牙周组织的再生。由于巨噬细胞在多种慢性炎症性疾病中都扮演着核心角色，因此这项研究成果具有广阔的临床应用前景，有望为关节炎、糖尿病并发症等疾病的治疗提供新的思路。
