《Biosensors and Bioelectronics》：Logic-gated CRISPR-Cas12a assay with engineered signal amplification for sensitive multiplexed detection of HCC miRNAs
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CRISPR-Cas12a结合环逻辑门与纳米探针实现肝癌标志物高灵敏检测，检测限达78.88 fM，临床验证与RT-qPCR高度一致。
郝江|杨俊元|钱成|李安怡|刘颖|张福清|邓玉林|段金燕|吕学飞
北京工业大学医学技术学院，北京，100081，中国
摘要
快速、灵敏且准确的多目标分析在生物医学检测中具有重要意义。然而，传统方法通常只是简单地组合了各个检测步骤，忽略了生物标志物之间的内在关系。为了解决这个问题，我们建立了一个新型生物传感平台，该平台将环对环AND逻辑门电路与工程化的CRISPR-Cas系统相结合，用于早期筛查肝细胞癌。在这个设计中，逻辑门处理多个miRNA输入（例如miRNA 122和miRNA 223），只有当它们同时被识别时，才会生成一个统一的DNA输出。这个输出直接激活CRISPR-Cas12a系统，该系统通过安装在DNA四面体和立方体框架探针上的多腿crRNA得到了增强，从而提高了切割活性和反应动力学。这种整合将复杂的多目标识别转化为一个单一的、放大的检测信号，最大限度地减少了系统干扰。
在最佳条件下，该方法对miRNA 122的检测限低至78.88 fM，对miRNA 223的检测限低至65.26 fM，血清回收率为89.66%–108.08%。使用36个样本进行的临床验证显示，该方法与RT-qPCR有极好的一致性（所有R2 > 0.98），ROC曲线下面积分别为0.8514和0.9244，有效区分了肝癌患者和健康个体。结合高灵敏度、特异性和临床适用性，这种策略为基于逻辑运算的多生物标志物分析提供了一个通用平台。未来，如果与微流控系统结合，可以实现自动化、高通量的检测，进一步提高其在即时诊断中的实用性。这种方法不仅对早期肝细胞癌筛查具有巨大潜力，而且通过调整输入逻辑，还可以用于检测多种癌症和其他疾病。
引言
快速、灵敏且准确的核酸生物标志物检测在疾病早期筛查、传染病预防和术后监测中具有重要意义（Azad和Chandra，2025；Lee等人，2015）。随着精准医学的发展，单一标志物的检测方法越来越无法满足诊断需求。相比之下，同时检测多个目标可以提供更全面的样本信息，提高分析效率并增加检测准确性（Behyar等人，2024；Li等人，2025b）。然而，传统的多重检测技术（如多重聚合酶链反应、多重荧光免疫测定和多重核酸杂交）大多在单一系统中分别检测每个目标。随着目标数量的增加，所需的探针和试剂数量也随之增加，这不仅增加了反应系统的复杂性，还增加了假阳性或假阴性的风险（Purohit等人，2019；Reese等人，2024）。此外，这些单独的检测方法忽略了生物标志物之间的内在关系。疾病的发病和进展通常涉及多个标志物或整个途径的协调变化，而不仅仅是单个分子的孤立改变（Srivastava等人，2023；Tian等人，2024）。此外，这些变化并不总是均匀的，在某些情况下甚至可能是相反的。例如，miRNA 21和端粒酶在恶性非侵袭性细胞（如MCF-7和SK-BR-3）以及转移性MDA-MB-231细胞中高度表达。相比之下，miRNA 31在非肿瘤细胞MCF-10A中表达最高，在MCF-7和SK-BR-3中显著降低，在MDA-MB 231中几乎不存在（Bai等人，2020）。因此，为了准确解释标志物的动态并提高诊断测定的特异性和准确性，开发新的检测技术至关重要（Nandi等人，2025）。
DNA逻辑运算采用数字电路中的布尔逻辑原理，使用生物分子作为输入信号。通过结合和链置换等分子相互作用，进行逻辑区分，从而产生特定的信号输出（Zhu等人，2022）。这一过程不仅能够分析多个输入信号之间的内在关系，还能减少试剂消耗，从而最小化信号干扰和非特异性反应（Li等人，2025a）。目前，AND门逻辑电路的主流设计是在信号放大之前进行AND逻辑运算，这有助于确保检测的特异性（Yan等人，2024）。然而，AND逻辑运算通常依赖于链置换，这一过程的动力学受到初始低丰度生物标志物的限制（Bi等人，2024；Liu等人，2023）。因此，对于基于AND门的多个生物标志物检测来说，这一步成为限制因素。因此，开发一种信号放大在逻辑运算之前或同时发生的检测策略可以显著加快多个生物标志物的检测速度。
除了优化传统DNA电路架构的努力外，探索新的信号生成方式也引起了极大的兴趣。其中，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统作为一种强大的信号生成工具，在快速核酸检测中表现出色，例如Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing（SHERLOCK）（Kellner等人，2019）、DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter（DETECTR）（Broughton等人，2020）、One-Hour Low-cost Multipurpose highly Efficient System（HOLMES）（Li等人，2018）和FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay（FELUDA）（Azhar等人，2021）等平台。由于其操作简单、可编程性和单碱基分辨率，基于CRISPR的检测被视为下一代核酸检测技术。尽管CRISPR系统的切割活性可以实现一对多信号放大，但这一过程并非无限可持续。随着切割的进行，激活的Cas蛋白会逐渐发生构象变化，导致失活。因此，提高切割活性仍然是改进基于CRISPR的检测的关键点之一。目前，有三种主要方法用于提高CRISPR/Cas系统的性能，包括工程化Cas蛋白（Yang等人，2023）、crRNA级联（Sha等人，2021）和底物探针优化（Rossetti等人，2022）。其中，工程化Cas蛋白相对复杂。结构修饰，如结构域交换或引入新的功能模块，可能会损害Cas蛋白的原始结构稳定性，从而影响切割活性和特异性。在级联CRISPR检测中，上游反应的产物作为下游Cas蛋白的特异性底物探针，从而提高信号（Sha等人，2021）。不幸的是，这种级联过程是“弱耦合”的，即上游产生的信号会扩散到下一层，使得级联放大效率低下且可选。通过底物探针优化增强热点是另一种有吸引力的方法（Rossetti等人，2022）。通过将底物探针固定在金纳米颗粒上，可以增加局部热点浓度，从而适度提高切割效率（Xu等人，2023）。然而，金纳米颗粒对发射信号的荧光淬灭效应可能会影响检测的灵敏度。尽管已经采取措施提高探针-Cas的亲和力并减少载体引起的干扰（例如，使用自组装的DNA四面体（Li等人，2023）或线性纳米结构（Liu等人，2019），但这些结构上的探针负载能力仍然限制了可实现的热点效果。
在这里，我们提出了一种环对环（C2C）AND逻辑电路，结合多腿crRNA（Mlegs）和立方体框架热点（CFH）探针检测方法，称为C2C-Mlegs-CFH，用于同时检测miRNA 122和miRNA 223。这两种miRNA是肝细胞癌（HCC）中的肿瘤抑制基因，都与上皮-间质转化（EMT）途径相关（Dong等人，2014）。它们的下调促进了EMT过程，从而增强了癌细胞的侵袭性、转移性和治疗抗性（Jiang等人，2008）。在我们的设计中，这两种miRNA的同时存在会触发级联C2C-滚动环扩增（RCA）反应，形成分支RCA（bRCA）产物，然后激活Mlegs-Cas12a复合物。激活的Cas12a对CFH探针表现出增强的切割活性，产生放大的荧光信号。这种集成设计解决了多目标miRNA检测中的三个关键挑战：（1）基于C2C的AND门电路将逻辑运算与信号放大独特地结合在一起，克服了传统AND门的动力学限制，确保了双目标的特异性。（2）Mlegs配置在空间上招募了多个Cas12a效应器，大大提高了激活效率，从而提高了检测灵敏度，而不影响特异性。（3）CFH探针作为一个密集包装的纳米结构支架，为报告探针创造了局部热点，有效放大了目标特异性信号，同时抑制了背景噪声。在对反应条件进行系统优化后，我们评估了所提出检测方法的灵敏度、特异性和准确性。此外，我们使用该检测方法在36个临床样本（18个来自HCC患者，18个来自健康对照组）中检测了miRNA 122和miRNA 223，并将结果与逆转录定量PCR（RT-qPCR）的结果进行了比较，从而验证了其在未来临床应用中的潜力。
试剂和材料
核酸（表S1）、胎牛血清（FBS）、Triton-X-100和Tween-20从Sangon Biotech（上海，中国）购买。Splint R Ligase、phi29 DNA聚合酶、LbCas12a和Nb.BbvCI从New England Biolabs（北京，中国）购买。Amicon Ultra-0.5离心过滤单元和Ultracel-30膜从Merck Millipore（达姆施塔特，德国）购买。柠檬酸钠盐缓冲液（SSC，20×）、磷酸盐缓冲液（PBS）和Tris-EDTA（TE）缓冲液从
Mlegs、CFH和C2C逻辑电路的设计以及C2C-Mlegs-CFH的工作原理
Mlegs由一个四面体DNA纳米结构（TDN）作为头部和三个增强的crRNA作为腿部构成。TDN是通过四种单链DNA（S1、S2、S3和S4）的自组装合成的，如图1a所示，形成了具有三个粘性末端的双链四面体结构。增强的crRNA比传统的crRNA长7个核苷酸，通过粘性末端杂交精细设计并连接到TDN上。
立方体框架热点探针
结论
在这项工作中，我们建立了一个强大的生物传感平台C2C-Mlegs-CFH，用于同时检测与HCC相关的miRNA。该系统旨在克服传统逻辑运算中固有的速率限制问题，即信号放大在目标识别之后进行，并提高Cas12a蛋白的切割动力学。
关键创新包括基于工程化CRISPR原理构建的多腿crRNA，这加速了Cas12a的
CRediT作者贡献声明
郝江：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。杨俊元：撰写——原始草稿、方法学。钱成：撰写——原始草稿。李安怡：撰写——原始草稿。刘颖：撰写——原始草稿。张福清：撰写——原始草稿。邓玉林：撰写——审阅与编辑、监督。段金燕：撰写——审阅与编辑、资源提供。吕学飞：撰写——审阅与编辑、监督、研究、概念化。
伦理批准
该研究方案已由中国解放军总医院的伦理委员会审查并批准（批准编号S2024-831-01，日期：2025.01.16）
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
