《Current Research in Microbial Sciences》：Biocontrol efficiency of native
Bacillus sp. HC-9 on honeysuckle leaf spot caused by
Alternaria alternata
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本研究针对由Alternaria alternata引起的金银花叶斑病，探索了本地分离的Bacillus sp. HC-9的生物防治潜力。研究通过体外抑菌实验、发酵上清液（CFS）稳定性分析、形态学观察、防御酶活性测定及温室和田间试验，证实HC-9能有效抑制病原菌生长（抑制率达70.91%），其CFS具有热、紫外和酸稳定性，并能诱导金银花产生系统抗性，田间防效高达80.52%。该研究为金银花叶斑病的绿色防控提供了高效生防菌种资源，对促进中药材可持续生产具有重要意义。
金银花（Lonicera japonica Thunb.）作为一种重要的传统中药材，以其清热解毒、抗病毒等功效闻名，尤其在新冠疫情期间成为连花清瘟、双黄连等制剂的关键成分，其经济价值和药用价值日益凸显。然而，随着规模化种植的推广，由Alternaria alternata（链格孢）引起的叶斑病严重威胁着金银花的产量和品质。在主要产区如贵州省绥阳县，该病发病率高达70%-85%，导致叶片早落，产量损失严重。目前，病害防治主要依赖苯醚甲环唑、多菌灵等化学杀菌剂，但长期使用易引发病原菌抗药性、环境污染及药材农药残留超标等问题，制约了金银花产业的可持续发展。因此，开发安全、有效的替代防控策略迫在眉睫。
生物防治利用植物有益微生物抑制病原菌，是实现绿色植保的重要途径。其中，源自植物自身叶际（phyllosphere）的本地微生物，由于对当地环境条件和宿主微生物组具有预适应性，往往表现出更强的定殖能力和生防效果。芽孢杆菌属（Bacillus）细菌，特别是枯草芽孢杆菌复合群（Bacillus subtilis species complex），因其生长快速、能形成抗逆芽孢，并能通过产生抗菌脂肽、细胞壁降解酶以及诱导植物系统抗性（ISR）等多种机制抑制病原菌，已成为最具应用潜力的生防菌类群之一。尽管其优势明显，但在金银花叶斑病防治中的应用研究仍较缺乏，尤其是田间防效验证不足。
在此背景下，研究人员从金银花叶片中分离到一株具有广谱抑菌活性的本地芽孢杆菌菌株HC-9。为了全面评估其防治金银花叶斑病的潜力，研究团队开展了一系列实验，旨在：（1）明确HC-9的分类学地位；（2）评估其体外和体内对A. alternata及其他植物病原菌的拮抗活性；（3）阐明其作用机制，重点关注细胞外酶产生和诱导宿主系统抗性；（4）通过温室和田间试验验证其防治效果。相关研究成果发表在《Current Research in Microbial Sciences》上。
为开展研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先，通过分子鉴定（16S rRNA和rpoB基因序列分析）对菌株HC-9进行分类学定位。其次，采用体外拮抗实验（如对峙培养法）评估其抑菌谱及对A. alternata菌丝生长和孢子萌发的抑制效果，并分析了其发酵上清液（CFS）在不同浓度、发酵时间以及热、紫外、pH条件下的稳定性。通过酶活性检测（如蛋白酶、几丁质酶等）探究其直接拮抗机制。此外，利用盆栽和田间试验（在贵州绥阳县金银花种植基地进行）评估其实际防效。在机理研究方面，通过测定金银花叶片中丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）积累（NBT和DAB染色）以及防御相关酶（POD、PPO、CAT）的活性，来揭示HC-9诱导系统抗性的生理基础。
3.1. 菌株HC-9的分子特征
通过16S rRNA和rpoB基因序列分析，构建系统发育树，结果表明菌株HC-9属于芽孢杆菌属，与B. subtilis物种复合群的成员亲缘关系最近，故在研究中将其鉴定为Bacillus sp. HC-9。
3.2. 菌株HC-9的体外抗真菌活性
3.2.1. 对病原菌菌丝生长的抑制
对峙培养实验显示，HC-9对A. alternata的抑制率达70.91%，并能有效抑制另外7种植物病原真菌（如Fusarium oxysporum, Bipolaris maydis等），表现出广谱抗真菌活性。
3.2.3. 无细胞上清液（CFS）的稳定性
HC-9的CFS在40°C至100°C热处理30分钟、紫外照射15-60分钟后，其抑菌活性保持稳定；在pH 5.0-9.0范围内活性较高，但在强酸（pH 3.0）和强碱（pH 11.0, 13.0）条件下活性显著下降。CFS的抑菌活性呈浓度依赖性，发酵48小时和72小时的抑菌率分别为72.79%和75.00%。
3.3. 菌株HC-9对A. alternata的作用模式
3.3.1. 细胞外酶的产生
HC-9能产生蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶，这些酶可能通过降解真菌细胞壁发挥拮抗作用。
3.3.2. 菌丝和孢子的形态变化
经HC-9 CFS处理后，A. alternata菌丝出现肿胀、扭曲、原生质泄漏等异常形态，孢子萌发率显著降低（抑制率达73.70%）。
3.4. 对金银花的生防效果
3.4.1. 温室条件下对叶斑病的防治效果
在温室实验中，HC-9在预防、治疗和保护性处理中均表现出显著的病害控制效果，接种后7天的防效分别为66.52%、68.52%和61.67%，与化学药剂（71.28%）相当。
3.4.2. 自然条件下的田间防效
2023年和2024年的田间试验表明，HC-9处理能显著降低病害指数，防效分别达到79.27%和80.53%，与化学药剂处理（82.4%和83.30%）无显著差异，证明其田间防效稳定可靠。
3.5. 诱导金银花的防御反应
3.5.1. 金银花中MDA含量的变化
接种A. alternata后，叶片MDA含量（脂质过氧化标志物）显著升高，而HC-9处理能缓解这种升高，表明HC-9减轻了病原菌引起的氧化损伤。
3.5.2. 活性氧（ROS）的积累
NBT和DAB染色显示，HC-9处理能诱导金银花叶片中超氧阴离子（O2?）和过氧化氢（H2O2）的短暂积累，这种ROS爆发是植物防御反应的早期信号。
3.5.3. 防御相关酶的活性
与病原菌共接种时，HC-9能显著增强金银花叶片中过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化氢酶（CAT）的活性，表明HC-9激活了植物的抗氧化防御系统。
综上所述，本研究证实本地分离的Bacillus sp. HC-9通过直接拮抗（产生细胞外酶和稳定抗真菌代谢物）和诱导系统抗性（ priming 抗氧化防御系统）双重机制，有效防治由A. alternata引起的金银花叶斑病。其广谱抑菌活性、代谢产物的稳定性以及在温室和田间表现出的高效、持久的防效，标志着HC-9作为一种有前景的微生物杀菌剂，为减少化学农药在药用植物栽培中的使用、推动中药材绿色安全生产提供了有力的技术支持和菌种资源。未来的研究将集中于鉴定HC-9产生的特定抗菌和ISR诱导代谢物，通过多组学技术解析其调控的宿主防御信号网络，并通过全基因组测序进行精确的分类学鉴定，为其商业化开发奠定基础。
