《Current Research in Microbial Sciences》：The TamA protein as a subunit vaccine improves immune protection against highly virulent
Klebsiella pneumoniae infection in mice
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本研究针对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)感染缺乏有效疫苗的难题，聚焦于高度保守的外膜蛋白TamA，开发了重组TamA亚单位疫苗。实验证明该疫苗能诱导高水平特异性IgG抗体(效价达1:217)，显著提高小鼠存活率(80% vs 对照组全部死亡)，并有效降低脏器细菌载量(肺脏降低约5000倍)和炎症因子水平。该研究为应对多重耐药菌感染提供了新型疫苗候选策略。
在微生物研究领域，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)正成为日益严重的公共卫生威胁。这种革兰氏阴性杆菌不仅是医院和社区获得性感染的常见病原体，更令人担忧的是其耐药性问题日益突出。随着抗生素的滥用，多重耐药(MDR)、广泛耐药(XDR)甚至全耐药(PDR)的肺炎克雷伯菌株不断涌现，使得临床治疗变得异常困难。据统计，该菌在抗生素耐药相关死亡细菌中位列第三，给全球医疗系统带来沉重负担。
面对这一严峻挑战，疫苗预防被视为最有前景的解决方案。然而，肺炎克雷伯菌疫苗研发却面临重重障碍。早期的全菌疫苗因毒性问题难以推广应用，而基于荚膜多糖(K抗原)和脂多糖(O抗原)的疫苗又受到血清型多样性的限制——肺炎克雷伯菌有80多种K抗原血清型，且不同血清型之间缺乏交叉保护作用。尽管O抗原血清型相对较少，但其免疫原性较弱，需要新的递送策略。其他候选靶点如菌毛蛋白、核糖体和外膜蛋白等也存在保护效果争议或交叉反应性问题。因此，寻找高度保守且能提供广泛保护的新型抗原靶点成为当前研究的重点。
在这一背景下，研究人员将目光投向了细菌的外膜组装机制。 translocation and assembly module (TAM)是一个由TamA和TamB两个亚基组成的蛋白质复合物，在革兰氏阴性菌的外膜蛋白组装过程中发挥关键作用。特别是TamA作为完整的外膜蛋白，不仅在不同肺炎克雷伯菌株中高度保守，不受血清型影响，而且暴露在细菌表面，易于被宿主免疫系统识别。前期研究表明，抑制tamA表达能够降低肺炎克雷伯菌的感染严重程度，这提示TamA可能是一个理想的疫苗候选靶点。
为了验证这一设想，河南医科大学的研究团队在《Current Research in Microbial Sciences》上发表了他们的最新研究成果。他们开展了一项系统性的实验研究，旨在评估重组TamA蛋白作为亚单位疫苗对高毒力肺炎克雷伯菌感染的免疫保护效果。
研究人员采用的主要技术方法包括：分子克隆技术构建pET-28a-TamA重组质粒，原核表达系统制备重组TamA蛋白，镍柱亲和层析进行蛋白纯化；使用BALB/c小鼠模型进行疫苗免疫评价，通过ELISA检测血清特异性IgG抗体效价；建立致死剂量细菌攻击模型评估保护效果，采用组织匀浆法测定脏器细菌载量；通过商业ELISA试剂盒检测组织炎症因子水平，进行组织病理学分析；利用荧光标记技术和细胞共培养模型进行细菌粘附抑制实验。
3.1. 重组质粒构建及纯化蛋白制备
研究人员成功克隆了肺炎克雷伯菌K13菌株的tamA基因，将其连接到pET-28a(+)表达载体中。经IPTG诱导后，在E. coli BL21(DE3)中表达出分子量约为64 kDa的重组TamA蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析证实了目标蛋白的正确表达。该蛋白主要以包涵体形式存在，通过镍柱亲和层析在变性条件下进行纯化，最终获得浓度为2.0 mg/mL的纯化蛋白，为后续免疫学研究奠定了基础。
3.2. TamA具有免疫原性并可诱导高水平抗体
免疫实验结果显示，TamA蛋白表现出强烈的免疫原性。小鼠经TamA加佐剂免疫后28天，血清中抗TamA特异性IgG抗体效价达到1:217，显著高于仅接受佐剂或PBS的对照组。在整个免疫过程中，未观察到小鼠出现明显的生理或行为异常，表明TamA疫苗具有良好的安全性。这一结果证实TamA能够有效激活体液免疫应答，产生高水平的特异性抗体。
3.3. TamA可保护小鼠免受高毒力肺炎克雷伯菌感染
保护性实验结果表明，TamA疫苗接种能提供显著的免疫保护。当用致死剂量(5×104CFU)的高毒力肺炎克雷伯菌K13菌株攻击小鼠时，TamA免疫组小鼠的存活率达到80%，而仅接受佐剂的对照组小鼠全部在72小时内死亡。PBS对照组小鼠均存活。这一显著差异证明TamA诱导的免疫应答能有效保护小鼠抵抗高毒力肺炎克雷伯菌的致命攻击。
3.4. TamA诱导针对hvKP攻击的保护性免疫
为进一步探究保护机制，研究人员检测了感染后小鼠主要脏器的细菌载量。结果显示，TamA免疫组小鼠肺、肝、脾、肾中的活菌数显著低于佐剂对照组。例如，肺脏中的细菌载量差异最为明显：TamA免疫组平均为9,724 CFU，而佐剂对照组高达5.08×107CFU，相差约5000倍。其他脏器也观察到类似的显著差异，表明TamA免疫能有效控制细菌在体内的扩散和繁殖。
同时，炎症因子检测发现，佐剂对照组小鼠各组织中IL-1β、TNF-α和IL-6水平显著升高，而TamA免疫组这些炎症因子水平与PBS对照组无显著差异，接近正常水平。这表明TamA疫苗接种不仅能减少细菌负荷，还能有效抑制感染引发的过度炎症反应。
组织病理学检查进一步证实了TamA的保护效果。佐剂对照组小鼠出现明显的组织损伤：肺组织表现为肺泡壁粒细胞浸润、增厚和肺泡间隔增宽；肝组织出现肝细胞水肿、坏死、血管充血和淋巴细胞浸润；脾组织显示粒细胞浸润伴淋巴细胞坏死、血窦扩张和广泛充血；肾脏表现为肾小管上皮细胞水肿和空泡变性。相比之下，TamA免疫组小鼠各组织病理变化轻微，接近PBS对照组，表明疫苗能有效减轻感染导致的组织损伤。
3.5. TamA抗体可抑制hvKP对肺上皮细胞的粘附
粘附是细菌入侵宿主的第一步。为探究TamA抗体的功能性作用，研究人员进行了粘附抑制实验。将绿色荧光蛋白标记的K13菌株与抗TamA血清共孵育后，与MLE-12肺上皮细胞共培养。结果显示，与佐剂对照组血清相比，抗TamA血清显著抑制了细菌对上皮细胞的粘附。CFU计数结果进一步定量证实了这一抑制效应，表明TamA诱导的抗体能通过阻断细菌粘附这一关键步骤来发挥保护作用。
研究结论与讨论部分强调，该研究首次系统评估了TamA蛋白作为肺炎克雷伯菌亚单位疫苗的免疫保护效果。与传统疫苗候选靶点相比，TamA具有独特优势：作为外膜蛋白组装机制的关键组分，它在不同肺炎克雷伯菌株中高度保守，不受血清型限制，有望提供广谱保护。实验结果表明，TamA疫苗能诱导强烈的体液免疫应答，产生高效价特异性抗体，并通过多种机制发挥保护作用：直接抑制细菌粘附、促进体内细菌清除、减轻组织病理损伤和控制炎症反应。
特别值得关注的是，该研究使用的是具有高毒力特征的临床分离株K13，其兼具经典肺炎克雷伯菌(cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)的特性，更能模拟临床实际感染情况。在相同感染模型下，TamA疫苗表现出的细菌清除效果显著优于某些已报道的疫苗候选物，这对应对临床高毒力菌株的威胁具有重要意义。
当然，研究也存在一定局限性，如保护效果仅在单一菌株上验证，且采用腹腔攻击模型而非更符合临床实际的呼吸道感染模型。未来研究需要扩大菌株验证范围，并在更相关的感染模型中进一步评估疫苗效果。此外，对抗体介导的具体保护机制(如调理吞噬作用)也需要更深入的研究。
总体而言，这项研究为肺炎克雷伯菌疫苗研发提供了新的思路和候选靶点，特别是在多重耐药菌问题日益严峻的背景下，TamA疫苗的开发具有重要的临床意义和应用前景。随着进一步优化和验证，TamA有望成为预防肺炎克雷伯菌感染的有效疫苗策略。
