《Frontiers in Molecular Biosciences》：Differential roles for CLA-1L and UNC-10 in endosomal maturation and peptide release at C. elegans synapses impacting lifespan
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本综述揭示了秀丽隐杆线虫中两种活性区蛋白CLA-1L和UNC-10/RIM通过差异性调控内吞体成熟（涉及ITSN-1、AP-2、RAB-5、RAB-7）和神经肽释放，进而影响突触功能和机体寿命的新机制。研究结合电镜、荧光成像和寿命分析，为理解突触蛋白在细胞器动态平衡和衰老中的作用提供了重要见解。
引言
在真核细胞中，内吞作用和自噬是相互关联的过程，共同维持细胞稳态。近期遗传筛选发现，秀丽隐杆线虫的Clarinet (CLA-1)蛋白，一种与活性区蛋白RIM、Piccolo和Fife-1相关的突触蛋白，在神经元自噬通路中扮演角色。具体而言，长亚型CLA-1L的缺失会破坏ATG-9在突触前的定位，模拟内吞突变体的表型，并导致自噬体形成缺陷。这些数据表明CLA-1L参与了内吞体通路和自噬通路的耦合。
内吞系统涉及细胞外和膜相关货物通过一系列内吞-溶酶体细胞器的内化和加工，每个细胞器都具有独特的分子标记、腔内内容和功能。内吞作用通常始于囊泡从质膜出芽。虽然网格蛋白介导的内吞作用是一条特征明确的途径，但非网格蛋白依赖的途径，如活动依赖性批量内吞（ADBE）和超快内吞作用（UFE），也参与膜回收。Intersectin (ITSN-1)是协调内吞通路早期阶段的几种蛋白之一。ITSN-1是一种高度保守的含SH3结构域的蛋白，富集于突触内吞区，并通过与AP-2相互作用与早期内吞体结合，作为动力蛋白、EPS-15/EHS-1和Synaptojanin的支架蛋白，这些蛋白已知在突触囊泡回收和内吞体分选中起关键作用。AP-2参与货物识别、网格蛋白笼组装和分裂机制的招募，在网格蛋白介导和批量内吞过程中均有助于囊泡回收。新形成的内吞囊泡可以与早期内吞体（EEs）融合，内化的货物可以在成熟前通过ESCRT或SNX-1/RME-8等复合物进行分选。内吞体成熟对于将内吞物质递送至溶酶体进行降解是必需的。小GTP酶（Rabs）调节EEs向晚期内吞体（LEs）的成熟。EEs由RAB-5标记，它调节新内吞的囊泡与现有EEs的融合，以及EEs之间的同型融合。LEs由RAB-7标记，它调节其同型融合以及LEs与溶酶体的融合。为了使内吞体从EE成熟为LE，RAB-5必须在一个被称为Rab5/Rab7转换的特征明确的过程中被RAB-7取代。在真核细胞中，内吞和自噬区室都与溶酶体融合，这是细胞稳态的一个汇聚点。
自噬是一个严格调控的分解代谢过程，降解和回收细胞质成分，如受损细胞器和错误折叠的蛋白，以维持细胞稳态。该过程的一个关键调节因子是ATG9（自噬相关基因9），它是唯一的跨膜自噬蛋白，在递送自噬体生物发生所需的膜方面起着关键作用。在神经元中，ATG9从高尔基体反面网络运输到突触，在那里以活动依赖性方式循环通过外吐-内吞循环。在秀丽隐杆线虫中，破坏这一循环的内吞突变导致ATG-9在网格蛋白富集的亚域中异常聚集，证明了内吞作用和自噬之间的耦合。ATG9运输的破坏会损害自噬体形成，并与人类神经退行性疾病相关，强调了协调的内吞-自噬-溶酶体通路在维持神经元健康中的重要性。
本研究使用cla-1长亚型突变体cla-1(ok560)和unc-10无效突变体unc-10(md1117)，分别简称为cla-1L和unc-10，以研究CLA-1L和UNC-10如何单独及组合调控内吞-溶酶体通路的关键组分，并探索其缺失的功能性后果。
结果
CLA-1L和UNC-10缺失破坏内吞机制组分ITSN-1和AP-2
CLA-1L是一个9000个氨基酸的蛋白，通过其C端锚定在突触前密度区，并将其非结构化的N端结构域延伸至活性区周围区域——该区域与网格蛋白介导的内吞作用相关。在CLA-1L的N端序列中，我们鉴定出一个包含大约20个PxxP基序的重复区域，这些是潜在的SH3结合域，可能与内吞蛋白相互作用。近期研究发现，cla-1L突变体和itsn-1突变体都会破坏ATG-9的突触前分布，并且在cla-1L;itsn-1双突变体中这种破坏增强。因此，我们探究了荧光标记的ITSN-1 (ITSN-1:GFP)是否受到CLA-1L缺失的影响，特别在背侧胆碱能神经肌肉接头（NMJs）的一个子集中，使用unc-129启动子，使得单个突触 puncta 清晰可辨。我们观察到在cla-1L突变体中，ITSN-1的峰值荧光强度显著降低，而沿背侧神经索（DNC）的 puncta 数量没有变化。考虑到cla-1的短亚型和中亚型，它们与CLA-1L共享一个共同的C端，在cla-1L突变体中仍然表达，这表明CLA-1L和ITSN-1之间的相互作用可能通过CLA-1L独特的富含脯氨酸的N端发生。由于UNC-10缺乏富含脯氨酸的结构域，我们预计UNC-10的缺失不会破坏ITSN-1的突触定位。这一点得到证实，实际上unc-10突变体表现出ITSN-1峰值荧光强度增加。对cla-1L;unc-10双突变体的分析显示，峰值荧光强度降低，与单独的cla-1L突变体相似，表明CLA-1L是ITSN-1正确定位所必需的组分。
鉴于ITSN-1是由衔接蛋白复合物2（AP-2）招募的，我们接下来探究了AP-2复合物（通过其荧光标记的α亚基APT-4:GFP可视化）是否受到CLA-1L缺失及相关突触ITSN-1减少的影响。有趣的是，在cla-1L突变体中，我们观察到表达APT-4的峰值荧光强度和 puncta 数量均显著增加。我们在unc-10突变体中也看到了APT-4峰值荧光强度和数量的类似增加。在之前的研究中，cla-1L和unc-10突变体的突触密度（通过多种内源性标记的突触蛋白的荧光 puncta 数量评估）并未发现增加，这表明单突变体中检测到的额外APT-4 puncta 可能代表异常的APT-4定位。在cla-1L;unc-10双突变体中，APT-4峰值荧光强度有类似的增加，尽管观察到的 puncta 数量增加未达到统计学显著性。由于ITSN-1在这些突变体中的影响不同，APT-4数据表明，cla-1L和unc-10突变体中ITSN-1荧光峰值强度和分布的变化可能存在不同的潜在原因。
内吞体标记物RAB-5和RAB-7的突触分布在cla-1L和unc-10突变体中受到干扰
一旦囊泡被内化，它们会去包被并与由RAB-5标记的早期内吞体融合。鉴于观察到的囊泡内吞蛋白变化，我们接下来在cla-1L、unc-10及双突变体的相同突触中检测了YFP::RAB-5。在cla-1L突变体中，RAB-5荧光峰值强度（而非 puncta 数量）显著增加，表明RAB-5在这些突触处积累。在unc-10突变体中，RAB-5峰值强度也有显著增加，尽管程度小于cla-1L突变体。在cla-1L;unc-10双突变体中，RAB-5峰值的强度与cla-1L突变体最为相似。
随着RAB-5在cla-1L突变体以及较小程度上在unc-10突变体的突触处积累，我们假设内吞体成熟可能受到破坏。为了验证这一点，我们检测了CFP::RAB-7的水平。虽然单突变体和双突变体中的 puncta 数量未受影响，但在cla-1L和cla-1L;unc-10突变体中，RAB-7荧光峰值的强度显著降低，而在unc-10单突变体中没有变化。unc-10突变体对RAB-7峰值没有影响并不完全令人惊讶，因为其对RAB-5水平的影响较小。综上所述，这些观察结果表明CLA-1L影响内吞体成熟的RAB-5向RAB-7转换步骤，而UNC-10的缺失虽然对内吞体通路有一些影响，但其作用似乎是次要的。
CLA-1L和UNC-10缺失导致多形性囊泡在NMJ突触积累
基于上述观察到的内吞和内吞体标记物的变化，我们探究了cla-1L和unc-10突变体是否表现出内吞体结构的突触异常迹象。为了检查这一点，我们进行了高压冷冻固定和冷冻置换电子显微镜（HPF/FS-EM）分析。来自cla-1L和unc-10突变体的NMJ显微照片显示，大多形性囊泡的数量显著增加：包括不规则和球形的清亮囊泡，通常通过丝状连接与其他囊泡聚集。引人注目的是，与cla-1L不同，unc-10突变体也积累了不同大小的致密核心囊泡（DCVs）。此外，cla-1L;unc-10双突变体积累了两种类型的囊泡，表明CLA-1L和UNC-10差异性调节NMJ处的囊泡组成。
UNC-10此前未被报道影响DCVs，鉴于这一发现的新颖性，我们采用一种成熟的肽分泌测定法来确定unc-10突变体中DCVs的积累是否反映了有缺陷的DCV融合。在该测定中，测量从运动神经元释放的荧光标记肽（NLP-21:Venus）在体腔细胞（coelomocytes）中的水平——这些内吞细胞负责从蠕虫的假体腔中摄取分泌蛋白。因此，体腔细胞NLP-21水平可作为神经元NLP-21释放的替代指标。该分析显示，在unc-10和cla-1L;unc-10突变体中，体腔细胞NLP-21荧光急剧减少，与NMJs肽分泌受损一致。正如在cla-1L突变体突触中观察到的正常DCV数量所预测的那样，NLP-21荧光水平未受影响，表明肽释放缺陷是unc-10突变体特有的。为了强化这一结论，我们进行了两个对照实验。首先，我们测量了DNC中的NLP-21水平，发现unc-10和cla-1L;unc-10双突变体中荧光峰值强度相应增加，与释放受损一致，而cla-1L突变体未受影响。其次，为了确保unc-10和cla-1L;unc-10体腔细胞中肽水平降低不是内吞活性缺陷的结果，我们将德州红标记的BSA（Texas Red-BSA）注射到假体腔中，并在20分钟后测量体腔细胞的摄取水平。所有品系中Texas Red的积累相似，证明体腔细胞的内吞功能未受损。
unc-10和cla-1L突变体中肽能释放缺陷的相对程度与其先前报道的突触囊泡（SV）外吐缺陷密切平行，后者在unc-10突变体中更为明显。这部分归因于unc-10突变体中UNC-2电压门控钙通道的突触表达减少更为严重。支持这一点的是，在1 mM与5 mM细胞外Ca2+下诱发的SV释放比较显示，unc-10突变体在钙依赖性释放方面比cla-1L突变体表现出更陡峭的下降。鉴于DCV释放需要比SV释放更高的钙浓度，这很可能导致了unc-10突变体中严重的肽分泌缺陷。
总之，cla-1L和unc-10突变体都表现出多种超微结构异常。在cla-1L和unc-10突变体中观察到的不规则囊泡的相对丰度反映了各自RAB-5积累的程度，表明这些囊泡可能代表未成熟的内吞体。这些数据支持先前将cla-1L与内吞体形成联系起来的遗传证据，并表明unc-10也可能参与内吞体通路。
cla-1L和unc-10突变体中溶酶体细胞器在胞体聚集
我们探究了cla-1L以及较小程度上unc-10突变体中EE向LE成熟的明显破坏是否可能影响内吞-溶酶体通路的后期降解阶段。为了研究这一点，我们检查了荧光标记的CTNS-1 (CTNS-1:RFP)的突触分布，这是一种完整的溶酶体膜蛋白。突触CTNS-1荧光 puncta 数量没有变化，尽管我们在cla-1L和unc-10单突变体中观察到CTNS-1荧光峰值强度有增加的趋势，但只有cla-1L;unc-10双突变体表现出显著增加。
上述结果可能是预期的，因为尽管一些溶酶体可能在突触处形成，但目前的数据断言，内吞-溶酶体融合和货物降解的主要部位发生在逆行运输后的神经元胞体中。因此，我们检查了cla-1L、unc-10和cla-1L;unc-10突变体胞体中的CTNS-1。虽然任何突变体中每个胞体的CTNS-1阳性簇的数量没有变化，但在cla-1L和unc-10单突变体以及cla-1L;unc-10双突变体中，簇的大小显著增加。
内吞-溶酶体系统的变化与cla-1L和unc-10突变体寿命缩短相关
内吞-溶酶体系统的缺陷与几种神经退行性和年龄相关疾病有关。此外，内吞-溶酶体通路已被证明与秀丽隐杆线虫的寿命调控相关，该系统的激活延长寿命，而其破坏导致寿命缩短。为了研究cla-1L和unc-10突变体是否影响寿命，我们检查了单突变体和双突变体的寿命。我们发现cla-1L和unc-10单突变体都表现出更短的寿命，蠕虫比WT对照早死大约3天。cla-1L;unc-10双突变体受影响更严重，比WT早死约7天。如果寿命减少是由于内吞体成熟和运输的破坏，我们假设itsn-1(tm725)无效突变体会表现出与cla-1L突变体相似的表型。与这一预测一致，itsn-1(tm725)突变体的寿命也缩短了3天。
为了确定cla-1L和unc-10突变体寿命缩短是否可能反映摄食缺陷，我们测量了咽部泵送速率。该测定发现unc-10和cla-1L:unc-10突变体的泵送速率显著降低，而cla-1L突变体未受影响。由于cla-1L和unc-10突变体都表现出类似的寿命缩短，我们可以得出结论，仅靠摄食速率降低不能解释这一结果。此外，由于cla-1L;unc-10双突变体的泵送速率并不比unc-10单突变体差，更严重的寿命减少不能仅归因于摄食缺陷。然而，观察到unc-10突变体影响摄食是很有趣的，并引发了关于突变体表型的哪些方面可能是其原因的问题，可能反映了突触和/或肽能信号传导的变化。
讨论
本研究揭示了RIM家族蛋白CLA-1和UNC-10/RIM在秀丽隐杆线虫突触处的新表型。具体而言，我们显示cla-1L在内吞-溶酶体通路中表现出异常，而unc-10突变体不仅调节突触传递（如前所述），而且深刻影响肽分泌。这些扰动伴随着寿命的叠加减少。
内吞体成熟通路
尽管cla-1L突变体对突触传递仅有轻微影响，但在EM水平上，我们观察到NMJs处不规则的内吞体囊泡大量积累，伴随着Rab-5表达增加和Rab-7减少。在哺乳动物Piccolo突变体中观察到类似的变化，该蛋白通过保守的C2和PDZ结构域与CLA-1具有同源性。与cla-1L突变体类似，Piccolo的缺失导致轻微的神经递质释放缺陷、轴突Rab5增加和Rab7表达减少，并与EM观察到的异常内吞体样结构积累相关。在大鼠Piccolo突变体的培养海马突触中观察到一个额外的表型，是深刻的突触囊泡回收缺陷。这种回收囊泡的无能与Rab5依赖性早期内吞体形成缺陷有关，该内吞体是回收SVs所必需的，这一表型可以通过表达保持激活GTP结合状态的Rab5(Q79L)突变体来挽救。Piccolo调控Rab5的机制已被广泛研究；这种调控通过锌指结构域与Pra1（异戊二烯化Rab受体1）的相互作用发生，后者将Rab5招募到早期内吞体（EEs）。Rab5随后被GEFs激活，Rab5–GTP招募EEA1和ITSN-1以驱动内吞体融合和突触囊泡（SV）回收。在Piccolo突变体中，受损的Pra1招募限制了EE形成和SV回收，这些缺陷可以通过表达Piccolo锌指或ITSN-1过表达来挽救。
CLA-1L在多大程度上可能与Piccolo具有保守的功能作用？虽然没有证据表明秀丽隐杆线虫有Pra1同源物，并且CLA-1L缺乏锌指结构域，但它可能以类似的方式发挥作用，通过不同的蛋白质相互作用将RAB-5靶向到内吞体以进行后续激活。CLA-1L N端存在多个PxxP基序，为与含有SH3结构域的蛋白质相互作用提供了机会，这可能导致Rab-5招募或激活缺陷，从而间接阻碍ITSN-1靶向，和/或CLA-1L可能直接招募ITSN-1。该模型得到先前证据的支持，即CLA-1L的突触周围N端在WT动物中与ITSN-1结合伙伴AP-2共定位。与CLA-1L相比，UNC-10可能在ITSN-1的定位中仅起次要作用，可能是突触传递减少的次要后果，这可能会减少SV回收。
RAB-5峰值强度的增加以及相关的RAB-7水平降低表明CLA-1L是内吞体发育和成熟所必需的。在cla-1L和unc-10单突变体及双突变体中体细胞CTNS-1簇大小的额外增加支持了这样的观点，即内吞通路早期的破坏对后续正常细胞稳态所需的货物降解具有影响。具有自噬缺陷和内吞体轴突运输缺陷的突变体也会积累溶酶体。因此，我们在cla-1L和unc-10突变体神经元中观察到的体细胞CTNS-1聚类增加可能是由于内吞体成熟缺陷以及溶酶体水解酶和其他有效降解所需的溶酶体蛋白运输缺陷导致的溶酶体降解减少所致。或者，当突触内吞体未能成熟为晚期内吞体时，未降解的物质在突触处积累，增加了体细胞中补偿性溶酶体生物发生的需求，导致溶酶体聚集。
多形性囊泡积累
内吞体功能障碍是阿尔茨海默病中已知的最早的病理生物学现象，其中患者神经元积累内吞体囊泡。突触处内吞体囊泡的积累可能源于神经递质释放缺陷、功能失调的内吞体和自噬通路以及溶酶体降解受损。CLA-1L在突触功能和关键自噬蛋白ATG-9的定位中的作用先前已被确立。本研究将CLA-1L置于内吞体成熟通路中，这一发现与先前的遗传证据一致，即在cla-1L中观察到的ATG-9错误分选在itsn-1和ehs-1突变中得到加剧。因此，CLA-1L的缺失可导致内吞-自噬溶酶体通路的破坏。在NMJs处，cla-1L突变体导致多形性囊泡积累，这一表型与itsn-1突变体共享，同时伴有内吞体标记物的变化。这与AIY神经元的超微结构形成对比，在缺乏CLA-1L的情况下，AIY神经元在EM水平上没有表现出明显的形态异常，但ATG-9在异常焦点中积累，并与网格蛋白共定位。AIY是一种高度特化的温度感觉神经元，具有异常大的突触和数千个SVs，这可能是其功能所必需的。这与本研究研究的小的en passant NMJs形成鲜明对比。cla-1L突变体超微结构表型的比较差异表明，虽然CLA-1L可以调控内吞-溶酶体和自噬通路，但这些通路可能被差异性利用以满足特定神经元的需求。
致密核心囊泡和神经肽释放
与cla-1L突变体相反，我们发现unc-10突变体NMJs积累DCVs，这与肽分泌减少相关。这些观察结果与近期文献一致，该文献证明了哺乳动物UNC-10同源物Rim在培养小鼠海马神经元DCV释放中的重要作用。在该研究中，突触DCV数量呈增加趋势，但更有说服力的是，使用光学报告基因发现其在刺激诱发的融合方面存在缺陷。Rim还被证明通过Rab-3相互作用与DCVs共运输，提供了一种将DCVs靶向释放位点并招募Munc-13的机制。最近出现的更多细节表明(M)UNC-13和Rim通过不同的Rim和(M)unc-13膜结合域在DCV和SV融合中协同作用。我们最近报道，unc-10突变体中UNC-13的突触前定位显著减少，可能反映了破坏的Rim依赖性相互作用，该相互作用被发现可以保护Munc-13免受蛋白酶体降解。这些研究，以及我们先前发现unc-10突变体UNC-2钙通道表达减少，为unc-10突变体中观察到的DCV积累提供了解释。有趣的是，一项BioRxiv研究发现，AP-2的α亚基在人背根神经节神经元的DCVs上定位。这一发现为unc-10突变体中观察到的APT-4（AP-2 α亚基）和AP-2相关Intersectin表达水平增加提供了一种可能的解释——作为致密核心囊泡积累的结果。
寿命
CLA-1L或UNC-10任一缺失单独导致过早死亡，并且两种蛋白的组合缺失加剧了这种寿命表型。Piccolo突变体小鼠与其WT和杂合子同窝仔相比也表现出增加的产后死亡率。在一项
