《Frontiers in Oncology》：A robust ammonia metabolism gene signature identified by machine learning predicts prognosis and immunotherapy response in clear cell renal cell carcinoma
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本研究通过整合多组学数据与机器学习算法，首次构建了肾透明细胞癌（ccRCC）的氨代谢风险评分（AMRS）模型。该4基因模型（含CSAD、IL4I1等）在外部验证中展现出卓越的预测效能（3/5/7年AUC>0.7），能有效区分免疫检查点抑制剂（ICI）治疗应答差异。实验验证揭示关键基因CSAD显著促进肿瘤迁移侵袭，为克服ccRCC免疫治疗耐药提供了新型生物标志物和潜在靶点。
分析基于初步模型
研究最初尝试基于程序性细胞死亡（PCD）相关基因构建肾透明细胞癌（ccRCC）预后模型。通过差异表达分析筛选出318个与PCD相关的差异表达基因，其中142个与总生存期（OS）显著相关。采用六种机器学习方法进行建模后，随机森林模型因其最高的C指数（0.647）被选为初步模型。然而在内部验证队列中，该模型表现不佳，Kaplan-Meier曲线未能显著分层患者OS。
通过KEGG/GO富集分析发现，这142个PCD相关基因显著富集于氨基酸和氨代谢通路，这一发现促使研究焦点转向探索氨代谢相关基因（AMGs）在ccRCC预后和免疫治疗疗效中的作用。
WGCNA和scRNA-seq分析
采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出六个共表达模块，其中蓝色模块与肿瘤相关性最强。该模块基因显著富集于谷胱甘肽代谢和细胞氨基酸分解代谢过程，证实了AMGs参与ccRCC肿瘤发生。
通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析七个ccRCC患者的肿瘤组织，鉴定出七种不同的细胞群体。比较CD8+T细胞与其他细胞类型的差异表达基因发现，397个差异表达基因显著富集于氨代谢过程，表明在单细胞分辨率下CD8+T细胞与氨代谢存在密切关联。
构建氨代谢风险评分预后模型
最终筛选出147个与OS相关的AMGs用于后续分析。通过LASSO回归结合多变量Cox回归和机器学习（随机森林）方法，构建了包含四个统计显著基因的AMRS预后模型。变量重要性测量显示各基因对模型的贡献度。
AMRS验证和多模型性能比较
生存分析显示，高风险患者比低风险患者预后显著更差。ROC曲线证明AMRS具有强大的预测性能，所有AUC值均超过0.7，部分超过0.8。
将AMRS与传统模型和现有氨相关基因模型进行比较，在相同的E-MTAB-1980验证队列中，AMRS在3年和5年时间点的预测效能优于其他模型。
基于AMRS的CNV和TMB分析
展示了AMRS组成基因的染色体位置及其在正常与肿瘤组织中的表达谱。基于AMRS的体细胞突变数据分析显示，高风险和低风险组之间存在不同的突变特征。肿瘤突变负荷（TMB）与AMRS呈正相关（R = 0.1，p = 0.036）。
临床相关性和药物敏感性分析
临床相关性分析显示，高风险组患者中III/IV期、T3/T4肿瘤、N1淋巴结受累和M1远处转移的比例更高，这与既定的临床预期一致。
药物敏感性分析确定了九种具有统计学显著性的化合物，低风险组在所有药物中 consistently 表现出更高的ln(IC50)值，表明高风险患者对治疗更敏感。
AMRS与ICI治疗分析
采用TIDE、ESTIMATE和CIBERSORT算法比较不同风险组的肿瘤免疫微环境（TIME）特征。分析显示高风险组TIDE评分显著更高，表明免疫逃避潜力增加，可能对ICI治疗产生抵抗。同时，升高的ESTIMATE评分反映了高风险组更复杂的肿瘤微环境。
在三个独立的ICI治疗队列中评估生存结果，发现高风险患者预后 consistently 更差。这种免疫学差异可能解释了风险组之间不同的免疫治疗反应，并证实了AMRS预测ICI治疗结果的能力。
mRNA表达验证
通过qPCR分析评估AMRS模型中四个AMGs在肿瘤和癌旁组织中的mRNA表达水平。结果显示CSAD、IL4I1和P4HA3在肿瘤标本中显著上调，而PSAT1在ccRCC组织中表达明显降低。
CSAD在ccRCC中作为肿瘤抑制因子的功能
为研究CSAD在ccRCC细胞中的功能作用，首先检测了其在四种ccRCC细胞系中的表达。qPCR分析显示所有四种肿瘤细胞系中CSAD表达均上调，其中769-P细胞表达最高，OSRC2细胞最低。Western blot分析显示，多个肿瘤样本（T1–T9）中的CSAD蛋白表达显著高于匹配的正常组织（N1–N9）。
为探索CSAD在ccRCC进展中的生物学功能，使用两种特异性siRNA（si-CSAD-1和si-CSAD-2）在四种细胞系中敲低其表达。集落形成实验显示，CSAD耗竭显著损害了ccRCC细胞的增殖能力。伤口愈合和Transwell实验表明，CSAD敲低显著减弱了所有四种ccRCC细胞系的迁移能力，迁移抑制普遍超过50-70%，侵袭抑制范围约为58%至78%。
讨论
虽然ICI已成为肾癌治疗的关键，但肿瘤通过协同机制发生免疫逃避，从而削弱治疗效果。现有文献证实，失调的氨代谢通过诱导CD8+T细胞死亡促进免疫逃避。然而，关于ccRCC中氨代谢的研究仍然有限，因此进一步研究其与预后和ICI疗效的关联对于开发新的治疗策略至关重要。
在肿瘤微环境中，氨主要来源于谷氨酰胺分解：谷氨酰胺酶催化L-谷氨酰胺转化为L-谷氨酸，释放氨。相反，氨的清除严重依赖尿素循环，通过将氨转化为毒性较低的尿素进行解毒。谷氨酰胺是支持快速细胞增殖的关键代谢燃料，在癌症生物合成中起重要作用。在ccRCC中，谷氨酰胺代谢显著失调，其代谢过程中产生的氨经过还原羧化形成二氢乳清酸，从而减轻毒性同时为核苷酸合成提供氮源。
尿素循环（UC）作为人体内氨解毒的核心代谢途径，其酶表达和在肿瘤中的作用仍存争议。在晚期乳腺癌中，增加的精氨琥珀酸合成酶（ASS1）表达增强促肿瘤巨噬细胞极化，抑制CD8+T细胞活性，促进肿瘤进展和免疫逃避。相反，肿瘤可能抑制UC酶以将碳/氮资源重新导向前体合成（例如嘧啶），最大化生物合成效率。重要的是，当肿瘤细胞抑制UC酶表达时，T细胞暴露于高氨环境，其中活性氧（ROS）破坏T细胞分化/增殖所需的必需氨基酸代谢，加剧T细胞耗竭并损害PD-1/PD-L1治疗反应。
AMRS对ICI疗效的预测能力在三个独立的接受免疫治疗的ccRCC队列中得到验证。免疫浸润分析可能部分解释了这一点，显示高风险患者富含CD4+活化记忆T细胞、T滤泡辅助细胞（Tfh）、调节性T细胞（Tregs）和M0巨噬细胞，而低风险患者显示NK细胞、树突状细胞和肥大细胞富集。
IL4I1、CSAD、P4HA3和PSAT1共同构成AMRS。IL4I1是一种溶酶体氨基酸氧化酶，通过JAK1-STAT3途径促进M2巨噬细胞极化，抑制T细胞功能，促进ccRCC免疫逃避和进展。P4HA3参与胶原生物合成，通过PI3K-AKT-GSK3β轴驱动ccRCC和结直肠癌的肿瘤进展。PSAT1参与丝氨酸代谢，在晚期ccRCC中过表达并与不良预后相关。CSAD调节牛磺酸代谢，可能与肝癌的免疫治疗预后有关。尽管CSAD在AMRS模型中的变量重要性排名第二，但排名最高的基因PSAT1已在ccRCC中对其预后和免疫治疗作用进行了研究和验证，而CSAD的生物学功能仍知之甚少。因此选择CSAD进行体外功能验证，结果证明CSAD敲低显著抑制ccRCC迁移和侵袭，表明其作为新型治疗靶点的潜力。
本研究存在一些局限性。首先，作为回顾性分析，存在固有的选择偏倚风险。其次，AMRS的预测能力需要与IMDC模型等既定模型进行进一步的比较验证。此外，需要更多的实验证据来验证AMGs在ccRCC中的表达并表征CSAD的功能。
结论
本研究探讨了AMGs在ccRCC中的作用，建立了能够稳健预测患者预后和ICI治疗疗效的AMRS。初步体外实验表明CSAD促进ccRCC细胞侵袭和转移，提示其作为治疗靶点的潜力。对于像ccRCC这样具有高维转录组数据但临床样本有限的癌症，整合传统模型与机器学习可能克服建模挑战。
