《Frontiers in Immunology》：Integrating zinc homeostasis network and immune landscape: a five-gene prognostic framework for precision oncology in lung adenocarcinoma
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本研究构建并验证了基于锌稳态网络相关基因的五基因预后模型，通过整合TCGA和GEO数据库的转录组与临床数据，结合LASSO回归和多变量Cox分析，证实该模型可有效预测肺腺癌（LUAD）患者生存风险。模型将患者分为高风险（HR）和低风险（LR）组，揭示高风险组具有免疫抑制微环境（如Treg和M2巨噬细胞富集）、更高肿瘤突变负荷（TMB）及对化疗（如顺铂）和靶向药物（如索拉非尼）的敏感性差异。体外实验验证SLC16A3（促癌）和EGR2（抑癌）在LUAD恶性行为中的关键作用，为LUAD的预后评估和个体化治疗提供新策略。
引言
肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌的主要亚型，占肺癌病例的近40%，具有显著的肿瘤异质性和治疗抵抗性。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂取得进展，超过60%的患者在12个月内出现耐药，凸显了对新型预后标志物的迫切需求。锌离子作为细胞内第二信使，其稳态失衡已成为肿瘤进展的新标志，通过激活MAPK、Akt等致癌通路及诱导上皮-间质转化（EMT）促进恶性进展。然而，锌稳态网络相关基因在LUAD免疫微环境重塑中的集体作用及多基因预后模型的潜力尚未明确。本研究旨在构建基于锌稳态网络的预后特征，为LUAD的精准治疗提供新见解。
材料与方法
研究从TCGA数据库获取541例LUAD肿瘤和59例癌旁组织的RNA-seq数据，使用Wilcoxon秩和检验筛选差异表达基因（DEGs），阈值设为错误发现率（FDR）<0.05且|log2折叠变化|>1.0。通过GeneCards获取锌转运相关基因集，鉴定出124个锌稳态网络相关DEGs。利用STRING数据库构建蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape的CytoHubba插件基于最大团中心性（MCC）算法筛选前60个枢纽基因。预后模型构建中，排除总生存期<30天的病例，通过单变量Cox分析识别16个预后相关基因，进一步经LASSO回归和多变量Cox分析最终确定五个关键基因（CAV1、KLF4、LDHA、EGR2、SLC16A3）。风险评分计算公式为各基因表达水平与其回归系数的乘积之和。患者按中位风险评分分为高风险组和低风险组。模型性能通过Kaplan-Meier生存曲线、时间依赖性ROC曲线和决策曲线分析（DCA）评估，并在GSE26939、GSE72094和GSE13213等GEO数据集中进行外部验证。免疫微环境分析采用七种反卷积算法（如XCELL、TIMER）、ssGSEA和单细胞RNA测序（scRNA-seq），评估免疫细胞浸润、免疫功能及免疫治疗反应标志物（如TIDE评分）。体外实验使用人LUAD组织样本和A549、H1975细胞系，通过siRNA敲低SLC16A3和质粒过表达EGR2，利用CCK-8、EdU、Transwell迁移实验及TUNEL染色、流式细胞术验证基因功能及顺铂敏感性。统计学分析使用R语言（版本4.3.3）和GraphPad Prism 7.0，显著性定义为p<0.05。
结果
锌稳态网络相关DEGs的鉴定与功能分析
差异表达分析识别出2,749个DEGs，其中1,868个上调，881个下调。与锌转运基因集交叉后获得124个锌稳态网络相关DEGs。PPI网络分析筛选出60个枢纽基因，包括转录调节因子（如PPARG、EGR2）、代谢相关基因（如SLC16A3、LDHA）和跨膜信号分子（如CFTR、CAV1）。GO和KEGG富集分析显示这些基因显著富集于缺氧反应、葡萄糖稳态、脂质定位等生物学过程，以及PPAR和HIF-1信号通路等致癌途径，提示锌稳态失调通过代谢重编程和缺氧适应参与LUAD进展。
五基因预后风险模型的构建与验证
单变量Cox分析鉴定出16个预后相关基因，经LASSO回归和多变量Cox分析最终形成包含CAV1、KLF4、LDHA、EGR2和SLC16A3的五基因模型。高风险组患者总生存期显著缩短，风险比（HR）为2.29。模型在TCGA队列中C-index为0.6766，时间依赖性ROC曲线显示1年、3年和5年AUC值均具预测能力。PCA和t-SNE分析证实高低风险组良好分离。模型在GSE26939、GSE72094和GSE13213等外部数据集中的C-index分别为0.6379、0.6513和0.6441，验证了其稳健性。临床相关性分析显示风险评分与晚期T分期、N分期和病理分期呈正相关，高风险组中晚期肿瘤比例更高。
预后列线图模型与临床效用
多变量Cox分析确认风险评分为独立预后因素。整合风险评分和临床特征的列线图C-index达0.713，校准曲线显示预测与观察生存率高度一致。决策曲线分析表明列线图在1-5年预测期内临床净收益优于单独临床参数，支持其作为辅助预后工具的价值。
风险模型的分子机制与免疫微环境特征
GO和KEGG分析揭示高风险组富集于糖酵解和葡萄糖分解代谢等代谢重编程通路，低风险组则激活Th1/Th2细胞分化等免疫相关通路。免疫浸润分析显示低风险组具有“热肿瘤”表型，免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分更高，效应免疫细胞（如B细胞、T细胞亚群）浸润增加，抗原呈递细胞（如aDC、iDC）和II型干扰素反应活性增强。高风险组表现出免疫抑制特征，TIDE评分、CAF评分、MDSC评分和Exclusion评分升高，提示免疫检查点抑制剂耐药。单细胞分析进一步揭示高风险上皮细胞与Tregs和M2型巨噬细胞间通信网络增强，可能通过配体-受体互作招募免疫抑制细胞，塑造免疫逃逸微环境。风险评分与免疫调节分子相关，正相关于CXCL5、CCL7、CXCL8、PVR、CD276等抑制性分子，负相关于CXCL14、CXCL16、CD40LG、CD28等刺激性分子。
药物敏感性分析与靶向治疗策略
高风险组对传统化疗药物（如顺铂、吉西他滨、多西他赛）及多靶点激酶抑制剂（如索拉非尼、舒尼替尼）、表观遗传调节剂（如环巴胺）更敏感。低风险组对mTOR抑制剂（如雷帕霉素）和EGFR抑制剂（如厄洛替尼）反应更佳。突变分析显示高风险组肿瘤突变负荷（TMB）更高，驱动突变富集于TP53、TTN等基因。
SLC16A3和EGR2的体外功能验证
qRT-PCR、Western blot和免疫组化证实SLC16A3在LUAD组织中上调，EGR2下调。敲低SLC16A3或过表达EGR2均显著抑制LUAD细胞增殖和迁移。顺铂敏感性实验显示，SLC16A3敲低降低顺铂诱导的凋亡，IC50值升高，与公共数据集（GSE213102、GSE222187）中SLC16A3在顺铂敏感细胞高表达的结果一致，支持其在化疗反应调控中的作用。
讨论
本研究系统识别锌稳态网络相关基因在LUAD中的预后价值，构建的五基因模型具有良好的风险分层能力。高风险组特征与代谢重编程、免疫抑制微环境及基因组不稳定性相关，可能从强化化疗和多靶点治疗中获益。低风险组的免疫激活表型提示免疫治疗潜力。实验验证强调SLC16A3和EGR2在LUAD恶性行为中的关键作用，SLC16A3还参与调节顺铂敏感性。局限性包括模型预测精度中等、回顾性数据偏差及部分基因功能未完全阐明，未来需前瞻性验证并深入机制探索。
结论
锌稳态网络相关五基因签名是LUAD预后的可靠指标，能识别免疫微环境异质性和治疗反应差异，为风险自适应精准治疗提供框架，具有临床转化潜力。
