微波辅助提取榛蘑总皂苷的工艺优化、成分鉴定及其抗肿瘤与抗氧化活性评价

《Frontiers in Nutrition》：Extraction, purification, and identification of total saponins from hazel mushroom and its application evaluation

本研究首次采用微波辅助提取（MAE）结合响应面法（RSM）优化榛蘑皂苷（SHM）的提取工艺，通过UPLC/Q-TOF-MS鉴定出22种活性成分（以倍半萜、腺苷等为主），并证实SHM具有显著抑制A549肺癌细胞和MG63骨肉瘤细胞增殖、诱导凋亡及清除DPPH自由基等抗氧化能力，为榛蘑资源在功能食品开发中的应用提供理论依据。

　　

1 引言

榛蘑（Tricholoma）作为药食同源真菌，富含多糖、甾醇等活性成分，但其皂苷类成分（SHM）的研究尚属空白。皂苷作为绿色无毒生物活性物质，具有抗肿瘤、降血脂及抗氧化等特性，广泛应用于医药和功能食品领域。本研究首次通过微波辅助提取（MAE）技术结合响应面法（RSM）优化SHM提取工艺，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF-MS）鉴定其化学成分，进一步评估其体外抗肿瘤与抗氧化活性，为榛蘑资源的高值化利用提供新策略。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

实验采用Agilent 1290系列高效液相色谱仪（HPLC）、紫外分光光度计（TU-1950）及流式细胞仪（Beckman）等设备。榛蘑原料采自吉林长白山，经干燥粉碎后过50目筛，于4°C保存。试剂包括MTT、DPPH、α-葡萄糖苷酶等，细胞株为A549人肺癌细胞和MG63骨肉瘤细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

2.2 MAE提取工艺

称取2.0 g榛蘑粉末，按固液比1:25 g/mL加入57.52%乙醇溶液，在微波功率369.75 W下提取20.00 min，过滤后得粗提物。通过正丁醇-水体系纯化，采用高氯酸显色法在372 nm波长下测定皂苷含量，标准曲线方程为Y=0.4538X-0.1471（R²=0.9998）。

2.3 响应面优化设计

采用Box-Behnken设计（BBD）四因素三水平实验，以固液比（X₁）、乙醇浓度（X₂）、提取时间（X₃）和微波功率（X₄）为变量，皂苷得率（Y）为响应值。通过二次多项式模型（Y=32.25+0.11X₁+0.29X₂-0.24X₃-0.00075X₄+...）分析各因素交互作用，模型R²=0.9559，显著性检验p<0.0001。

2.4 成分鉴定与活性评价

UPLC/Q-TOF-MS分析条件：Agilent C18柱（2.1×50 mm，1.7 μm），流动相为5%乙酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脱。质谱采用电喷雾离子源（ESI），扫描范围m/z 50-1200。

抗肿瘤活性通过MTT法检测SHM对A549和MG63细胞的抑制率， Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞凋亡。抗氧化实验包括羟基自由基（•OH）、DPPH自由基清除能力、总抗氧化活性及还原力测定，以维生素C（Vc）为阳性对照。

3 结果与讨论

3.1 单因素优化结果

固液比1:20 g/mL时皂苷得率最高（15.81%）；微波功率300 W时得率达峰值（17.13%）；提取时间10 min时得率升至18.68%；乙醇浓度50%时得率最高（23.47%）。

3.2 响应面优化验证

最佳工艺为乙醇浓度57.52%、固液比1:25 g/mL、提取时间20.00 min、微波功率369.75 W，理论得率34.29%，实测平均得率34.61%，验证模型可靠性。3D响应面图显示固液比与提取时间（X₁X₃）交互作用显著（p<0.02）。

3.3 成分鉴定

UHPLC-MS从SHM中鉴定出22种化合物，包括14种倍半萜（如armillaridin）、3种腺苷、3种甾醇、1种嘌呤和1种二萜，推测其抗肿瘤活性与倍半萜类成分相关。

3.4 抗肿瘤活性

SHM浓度在25-400 μg/mL时对A549和MG63细胞增殖抑制率呈剂量依赖性，最高分别达93.58%和87.07%。流式细胞术显示，400 μg/mL SHM处理24 h后，A549和MG63细胞早期凋亡率分别升至68.60%和68.20%，表明SHM通过诱导凋亡抑制肿瘤生长。

3.5 抗氧化能力

SHM对羟基自由基清除率在1.25 mg/mL时达40.13%（Vc为99.17%）；DPPH自由基清除率在25 mg/mL时达94.01%（Vc为96.78%）；总抗氧化活性及还原力均随浓度上升而增强，但低于Vc，可能与样品中酚类物质含量较低有关。

4 结论

本研究建立了一种高效、环保的MAE-RSM联用技术用于榛蘑皂苷提取，鉴定出多种活性成分，并证实SHM具有显著的抗肿瘤和抗氧化潜力。未来需进一步开展体内实验验证其药理稳定性，为榛蘑在功能食品及辅助抗肿瘤药物开发中的应用提供数据支撑。