《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Electroactive electrospun nanoplatform combined with electrical stimulation modulates anti-inflammatory macrophage polarization for enhanced wound healing
1 Introduction
组织损伤已成为全球主要的健康挑战之一，每年有超过1400万人受累。组织修复是人体生命中最复杂的生物过程之一，涉及凝血、炎症、新组织形成和组织重塑四个阶段。在这一过程中，免疫微环境发挥着至关重要的作用。巨噬细胞作为免疫微环境的关键组成部分，具有广泛的功能，包括组织修复以及调节稳态和免疫。因此，调控巨噬细胞成为控制免疫微环境以促进组织修复的重要手段，其中巨噬细胞从促炎（M1）向抗炎（M2）的表型转化尤其受到关注，因其能改变细胞因子分泌谱，促进IL-10和转化生长因子（TGF）-β1等抗炎因子的分泌。
传统上认为免疫细胞功能完全由生化信号调控。近年来发现，物理信号在细胞微环境中同样至关重要，其中电刺激（ES）是一种潜在的物理信号。研究表明，外源性ES可促进巨噬细胞向抗炎（M2）表型转化，对组织修复产生有益影响。因此，将ES与具有良好导电性的支架材料相结合，为新型伤口敷料的设计提供了突破。
静电纺丝技术制备的取向纤维支架因其优异的力学性能和生物相容性而成为一种重要的支架制备方法。聚氨酯（PU）是一种热塑性聚合物，具有良好的力学性能、优异的弹性、高耐久性、良好的生物相容性和生物可降解性。在导电纳米材料中，碳纳米管（CNTs）因其强大的力学性能、导电性、高生物安全性以及相对易于制造和功能化而脱颖而出。因此，本研究采用静电纺丝技术制备导电PU/CNT纤维支架，并将其与外源性ES相结合，旨在评估其对巨噬细胞表型转化和细胞因子分泌的影响，以及在大鼠伤口愈合模型中的作用，为组织修复生物支架的未来发展提供有价值的指导。
2 Materials and methods
2.1 Materials
PU购自Sigma-Aldrich。多壁碳纳米管（MWCNTs）购自北京鸿鹄联合化工产品有限公司。N, N-二甲基甲酰胺（DMF）购自上海麦克林生化科技有限公司。小鼠RAW264.7巨噬细胞系购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
2.2 Preparation of electrospun nanofibrous scaffolds
通过静电纺丝在优化条件下制备纳米纤维支架。将0.7 g PU溶解于10 mL DMF中，室温搅拌12小时，制备7% (w/v) PU纺丝溶液。通过添加特定量的MWCNTs（PU/CNT比例为1000:1）制备PU/CNT纺丝溶液。在21°C和50%相对湿度下进行静电纺丝。纺丝液装入带有不锈钢针头的20 mL注射器中，通过CNC注射泵以1.5 mL/h的流速在20 kV电压下进行静电纺丝。纳米纤维支架收集在防静电无纺布上，接收距离设置为17 cm。真空干燥过夜后，获得PU和PU/CNT膜用于后续实验。
2.3 Characterization of nanofibrous scaffolds
通过扫描电子显微镜（SEM）观察纳米纤维支架的形态结构。通过ImageJ软件从SEM照片测量纤维直径。通过透射电子显微镜（TEM）观察PU和PU/CNT膜的内部结构。使用四探针系统测量PU和PU/CNT膜的电导率。
2.4 Cell cultivation and cellular intervention
选择小鼠RAW264.7巨噬细胞系进行实验。将细胞以5 × 104cells/cm2的密度接种在PU和PU/CNT膜上。附着24小时后，PU/CNT组的细胞暴露于直流（DC）电场（150 mV/mm），每天10分钟（PU/CNT + ES组）。电场通过固定在PU/CNT膜相对两端的两个平行电极施加，并连接到直流电源。将培养在无ES的PU膜（PU组）和无ES的PU/CNT膜（PU/CNT组）上的细胞用作对照。
2.5 Cell proliferation assay
在培养1、3和5天后，使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）评估RAW264.7细胞的增殖情况。在450 nm波长处测量吸光度。
2.6 Live/Dead cell staining
在第3天使用Live/Dead细胞染色检测三组RAW264.7细胞的活力和增殖情况。活细胞显示绿色荧光，死细胞显示红色荧光。
2.7 Immunofluorescence staining
培养3天后，固定细胞，使用针对Arg1和iNOS蛋白的兔多克隆抗体进行免疫荧光染色，并使用DAPI染色细胞核。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察和捕获荧光图像。
2.8 Quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR)
在第3天使用TRIzol试剂从处理的RAW264.7细胞中提取总RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit从分离的RNA合成互补DNA（cDNA）。使用PrimeScript RT Master Mix进行定量逆转录PCR（RTqPCR），并使用CFX96实时PCR系统进行定量。使用2?ΔΔCt方法将靶基因表达水平归一化至看家基因GAPDH。
2.9 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
在第3天收集所有组的细胞培养上清液，并通过ELISA试剂盒评估促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-10）的产生。
2.10 Animals and surgical procedures
所有动物实验均经北京大学人民医院动物伦理委员会批准。将40只雌性SD大鼠随机分为四组（n=10/组）：Control组、PU组、PU/CNT组和PU/CNT + ES组，每个组有四个评估时间点：第0、3、7和14天。在背部制造直径为1 cm的皮肤缺损伤口。伤口表面分别覆盖PU或PU/CNT，分别指定为PU组和PU/CNT组。在ES组中，将两个平行碳橡胶电极固定在大鼠的剃毛背部皮肤上，确保伤口和覆盖的PU/CNT敷料位于它们之间。然后通过直流电源每天施加强度为100 mV/cm的10分钟直流ES。在治疗后第0、3、7和14天拍摄伤口照片。伤口愈合率计算公式为：伤口愈合率 = (A0- A)/A0× 100%，其中A0为初始伤口面积，A为当前伤口面积。
2.11 Histological and immunohistochemical analysis
在第7天和第14天处死大鼠。收集标本并固定在4% PFA中24小时。将标本包埋在石蜡中，用于常规组织学苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色（MT）染色分析。通过免疫荧光染色检测TNF-α和IL-10的水平。检查每组大鼠的心脏、肺、肝、脾和肾的HE染色以评估体内生物安全性。
2.12 Statistical analysis
定量结果每组至少获得5个样本，实验至少重复3次。所有数据均表示为平均值±标准差（SD）。使用Stata 19.0通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行组间统计比较，p < 0.05认为有统计学差异。
3 Results
3.1 Characterization of nanofibrous scaffolds
SEM结果显示，静电纺丝纤维呈现连续形态且平行排列。PU/CNT组的平均纤维直径（0.227 ± 0.12 μm）略大于PU组（0.205 ± 0.07 μm），但差异无统计学意义。TEM图像显示了两组纳米纤维膜的内部结构，可以清晰识别CNTs在PU/CNT纤维中的位置。PU和PU/CNT膜的电导率测量值分别为10–6和100S/m，表明添加CNTs后纤维膜的电导率有统计学显著增加（**p < 0.01）。
3.2 Cytocompatibility of nanofibrous scaffolds
通过体外培养RAW264.7巨噬细胞研究纳米纤维膜和外源性ES的生物相容性。CCK-8测定结果显示，RAW264.7细胞在三组中在第1、3和5天持续增殖。值得注意的是，PU/CNT + ES组的细胞增殖水平显著高于PU组和PU/CNT组。同时，在Live/Dead染色结果中，所有组在第3天均表现出良好的细胞活力，显示强绿色荧光。PU/CNT + ES组显示最密集的绿色荧光，而所有组中很少观察到红色荧光。这些发现表明纳米纤维膜和外源性ES的细胞毒性极小，对RAW264.7细胞的活力没有显著影响。
3.3 Effect of ES on the behavior of macrophages
免疫荧光染色用于检测iNOS和Arg1的表达，这两种酶分别是巨噬细胞M1和M2表型的标志酶。PU/CNT + ES组在iNOS染色中显示最弱的荧光，在Arg1染色中显示最强的荧光。与其他组相比，PU/CNT + ES组显示Arg1显著上调，同时iNOS下调。差异具有统计学意义，表明ES可能促进M2极化。PCR结果显示，与PU组相比，PU/CNT + ES组中TNF-α和IL-6的相对mRNA表达水平分别降低了约54%（p < 0.05）和65%（p < 0.01），而IL-10和Arg-1的表达分别上调了8.927倍（p < 0.01）和7.940倍（p < 0.01）。在IL-10和Arg-1的表达上，PU组和PU/CNT组之间也观察到显著差异（p < 0.01）。此外，用于定量相关炎症因子分泌的ELISA结果显示，与PU组和PU/CNT组相比，PU/CNT + ES组显示TNF-α和IL-6水平显著下调（p < 0.05或p < 0.01），IL-10水平显著上调（p < 0.01）。PU组和PU/CNT组之间也观察到显著差异（p < 0.05或*p < 0.01）。
3.4 Evaluation of ES on promoting wound healing
造模和分组后，在术后第0、3、7和14天观察并记录伤口愈合情况。结果表明，所有组的伤口尺寸随时间推移而减小。与第0天相比，到第14天，Control组、PU组和PU/CNT组的伤口愈合率分别达到63.85%、69.55%和77.42%。PU/CNT + ES组表现出显著高于其他三组的伤口愈合率（94.67%）（**p < 0.01）。这些发现证明，与单独使用PU和PU/CNT相比，PU/CNT + ES在促进伤口愈合方面更有效，表明ES在伤口愈合过程中发挥积极作用。
3.5 Histological analysis
组织学分析显示，与其他组相比，PU/CNT + ES组表现出更窄的伤口宽度、更厚的肉芽组织和更高的胶原比例。在第14天，PU/CNT + ES组的伤口宽度（2870 ± 119.2 μm）显著低于Control组（5840 ± 545.1 μm）、PU组（4249 ± 384.8 μm）和PU/CNT组（3584 ± 110.0 μm）（p < 0.01）。在第14天，PU/CNT + ES组再生肉芽组织的厚度（4203 ± 122.6 μm）高于Control组（2597 ± 82.39 μm）、PU组（3025 ± 118.4 μm）和PU/CNT组（3582 ± 119.7 μm）（p < 0.01）。在第14天，PU/CNT + ES组的胶原比例（76.80% ± 2.775%）高于Control组（57.20% ± 2.775%）、PU组（62.20% ± 3.493%）和PU/CNT组（67.20% ± 3.421%）（**p < 0.01）。这些数据表明，PU/CNT + ES组具有优于其他组的促进伤口愈合的能力。
3.6 Immunohistochemical analysis
免疫组织化学分析用于进一步评估纳米纤维支架在体内促进炎症调节的作用。结果显示，与Control、PU和PU/CNT组相比，PU/CNT + ES组显示TNF-α水平显著下调（p < 0.01），IL-10水平显著上调（p < 0.01）。
3.7 Evaluation of biosafety in vivo
为了研究支架对其他器官（包括心、肝、脾、肺和肾）的生物毒性作用，比较了第14天Control、PU、PU/CNT和PU/CNT + ES组大鼠这些器官的HE染色。HE染色结果显示，植入纳米纤维支架的大鼠器官未发现明显损伤，表明纳米纤维支架及其代谢物对循环系统、呼吸系统、消化系统和代谢系统没有明显的不利影响。
4 Discussion
组织修复通常分为四个阶段：凝血形成、炎症、新组织形成（包括再上皮化和肉芽组织形成）以及组织重塑和消退，每个阶段涉及多种细胞类型。巨噬细胞作为异质性髓系细胞群，在修复过程中扮演着众多协调角色。目前，组织修复策略主要关注材料本身的内在特性，以及材料的负载能力。然而，涉及额外物理刺激的策略研究仍然不足。值得注意的是，体内的所有细胞，不仅是兴奋的神经和肌肉细胞，都能产生和接收稳态生物电信号，这是调节和控制细胞数量、位置和类型的关键因素。因此，外源性ES可能代表一种模拟体内再生微环境并促进组织修复的新策略。
本研究成功采用静电纺丝技术制备了PU/CNT纳米纤维支架。这些支架具有平行排列的纤维和良好的表面结构，模拟了细胞外基质的复杂结构。纳米纤维支架表现出高孔隙率，为促进细胞增殖和分化提供了充足的空间。PU具有优异的生物力学性能，为组织修复提供了适当的拉伸强度、抗疲劳性和柔韧性，与水凝胶相比能提供更好的结构支撑。先前研究表明，含有CNTs的复合纳米纤维支架可以在空间上引导细胞生长并增强信号传输，从而促进体外组织修复。本研究中，整合CNTs提高了纳米纤维支架的电导率和机械强度。CNTs的加入使支架的电导率从10–6S/m（PU组）显著增加到100S/m（PU/CNT组），为有效的ES传递提供了理想平台。此外，SEM和TEM结果显示两组纤维支架均表现出良好的取向性，表明CNTs的添加不影响支架的取向。纳米纤维支架的取向作为一个重要的拓扑引导线索，在细胞定向生长和迁移等过程中起着至关重要的作用。同时，高度取向的结构可以优化ES在支架上的传导和输出性能。总体而言，PU/CNT支架展示了预期的导电性和体内微环境模拟，为组织修复创造了有利的微环境。
在早期阶段，组织巨噬细胞产生线粒体ROS并驱动几个早期修复过程，放大炎症反应。后期，巨噬细胞的特征是线粒体呼吸和分解代谢功能，抑制炎症，调节ECM沉积，并促进组织修复。过度的早期炎症可能导致损伤后ROS过量产生，破坏钙稳态，引起细胞膜脂质过氧化，并导致核酸和蛋白质损伤。此外，ROS可促进巨噬细胞M1极化，进而通过STAT1、NFκB、p38 MAPK和NLRP3炎性体等多个信号通路激活炎症活化。显然，调节炎症反应和促进巨噬细胞的抗炎转化在组织修复中至关重要，巨噬细胞表型从促炎到抗炎的动态转变起着关键作用。当巨噬细胞极化时，它们分化为功能相反的M1和M2巨噬细胞。M2巨噬细胞表达更高水平的Arg-1、甘露糖受体（CD206）、IL-10以及趋化因子CCL17和CCL22，这些在组织修复、血管生成和代谢中发挥重要作用。因此，本研究设计的联合策略旨在减轻过度炎症的有害影响，并促进巨噬细胞M2极化以利于组织修复过程。
在实验设计的巨噬细胞模型选择中，各种巨噬细胞系表现出不同的优缺点。其中，RAW264.7和THP-1是广泛使用的巨噬细胞模型。RAW264.7细胞源自小鼠白血病单核细胞，对ES和纳米材料等物理/化学刺激表现出高敏感性。然而，极化巨噬细胞在人和小鼠细胞系之间仍存在显著差异。人THP-1细胞的优势在于更接近人类病理生理环境，但它们需要被PMA诱导分化为巨噬细胞样状态，这可能会引入额外变量且表型稳定性较低。因此，如果侧重于临床转化，应使用THP-1细胞验证关键机制以弥补人和小鼠免疫反应的差异。如果侧重于高通量筛选或机制探索，RAW264.7由于其操作简便性仍然是首选。本研究使用RAW264.7细胞作为初始机制探索的细胞模型。未来，采用多模型互补策略，例如先用小鼠源细胞进行初步筛选，再用人类源细胞进行验证，将进一步提高研究的可靠性和普适性。
良好的生物相容性是生物材料功能的基础。它指的是在预期的临床使用期间体内产生适当的宿主反应。在组织工程中，支架为细胞附着、增殖和分化提供支持。因此，如果细胞在支架表面和整个细胞外基质上附着和迁移，随后细胞增殖和沉积新的基质，则该组织工程支架和植入材料可以被认为是生物相容的。本研究中，利用WMCNTs赋予PU纳米纤维支架导电特性，归因于其独特的机械、物理和电子特性。然而，WMCNTs的安全性和毒性仍存在争议。一些研究报告了给小鼠施用不同浓度CNTs后肺部形成肉芽肿，表现出肺相关细胞毒性。相反，其他研究表明CNTs可以有目的地与蛋白质、核酸和细胞相互作用，表现出良好的细胞相容性，并在组织修复中发挥积极作用。CCK-8和Live/Dead染色是常用于评估支架细胞增殖和细胞毒性的试剂。本研究结果显示，所有组中的细胞均表现出良好的增殖和存活率。CNTs的添加不影响CCK-8值，甚至促进了细胞增殖。这可能归因于多种因素影响CNTs在生理环境中的毒性水平，包括金属催化剂和加工方法。通过静电纺丝技术整合到PU支架中后，CNTs在生理条件下表现为无毒。此外，它们的导电性和ES表现出协同效应，从而促进细胞增殖。在体内生物相容性评估中，各组大鼠器官的H&E染色未显示显著损伤，进一步证实了纳米纤维膜的生物安全性。
大量研究已证明ES在组织修复中的有益作用。iNOS和Arg1分别作为M1和M2巨噬细胞的标志物。本研究中，免疫荧光实验揭示ES可以上调Arg1表达，同时下调iNOS表达，表明ES促进巨噬细胞M2极化，这与先前发现ES可通过抑制MAPK/JNK信号通路并激活氧化磷酸化和ATP合成来调节巨噬细胞表型的研究结果一致。此外，动物实验中伤口愈合的观察结果，以及HE和Masson染色的结果，证明ES可以减少伤口长度、再生肉芽组织并增加胶原比例，从而促进伤口愈合。ES参数的调整对于发挥这些效应至关重要。因此，设置最安全、最有效的ES参数，如电压、频率、时间、ES模式，是未来研究的一个关键点。低电压（<50 mV/mm）效果有限，而过高的电压（>200 mV/mm）可能损伤细胞。不同频率的ES也表现出不同的效果。研究发现500 Hz ES组的细胞存活率最高。此外，不同的ES模式，包括直流电（DC）、交流电（AC）、脉冲电流（PC）和脉冲电磁场（PEMF），已被证明在组织修复中具有有益作用，但它们对巨噬细胞代谢和表型转化的影响仍不清楚。
在机制研究中，PU/CNT纳米纤维支架通过传递外源性ES信号，上调了与巨噬细胞M2表型相关的基因（如Arg1和IL-10）的表达，并抑制了与M1表型相关的基因（如TNF-α和IL-6）的表达。ELISA是一种用于定量检测生物样品中抗原或抗体的免疫分析技术，其结果也提供了令人信服的证据，表明外源性ES信号可以增强抗炎蛋白IL-10的表达，并减少炎症蛋白TNF-α和IL-6的表达。体内免疫组织化学分析进一步证实ES促进了IL-10的表达并抑制了TNF-α的表达。这些发现表明ES促进巨噬细胞M2极化，进一步调节其细胞因子分泌谱，并将巨噬细胞功能从促炎转变为抗炎。另一方面，IL-10常用于体外诱导巨噬细胞M2极化。大量研究也表明IL-10因子是调节巨噬细胞活化途径的关键因子，其高表达已被证实在体内和体外促进巨噬细胞M2极化。这表明巨噬细胞极化和巨噬细胞分泌细胞因子具有相互促进的作用，共同重塑再生过程中的免疫微环境。
我们体外和体内发现的一致性强烈表明，在大鼠中观察到的促进伤口愈合表型在机制上源于ES驱动的细胞水平免疫调节。虽然我们的数据清楚地证明PU/CNT + ES组促进了M2样细胞因子谱，但一个有趣的问题仍然存在：ES的物理信号如何转化为持续的前再生巨噬细胞表型。除了MAPK/JNK等潜在信号通路之外，免疫代谢的最新见解提出，巨噬细胞的功能极化是由基本的代谢重编程所支撑的。通常，M1巨噬细胞表现出增强的糖酵解，而M2细胞显示出
