《Frontiers in Genetics》：Systematic analysis of anoikis-related genes identifies SRPX2-FAK/AKT-IL-6 axis in the progression and peritoneal metastasis of gastric cancer
引言
胃癌（Gastric Cancer, GC）是全球范围内严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤。据统计，2022年全球新发胃癌病例超过96.8万例，死亡病例近66万例，其发病率和死亡率均位居第五。胃癌的发病率存在地域差异，东亚和东欧地区的发病率最高。近年来，随着幽门螺杆菌根除、早期癌症筛查以及诊疗策略的优化，胃癌的总体发病率和死亡率呈逐渐下降趋势。然而，由于早期症状隐匿，大多数患者确诊时已处于晚期并发生远处转移，预后极差。转移性胃癌患者的5年生存率低于10%。腹膜是胃癌常见的转移部位，约53%–66%的晚期胃癌患者会发生腹膜转移（Peritoneal Metastasis, PM），这对常规治疗策略构成了重大挑战。随着影像技术的进步，许多研究通过筛选有效的影像组学特征来构建PM的个体化预测模型。然而，关于胃癌腹膜种植和转移分子机制的研究仍然有限。因此，识别能够有效预测不良预后和PM风险的生物标志物，对于晚期胃癌治疗靶点选择和临床决策指导具有重要意义。
当细胞因缺乏或异常粘附而从细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）脱离时，会通过一种特定的凋亡形式被清除，即“失巢凋亡”（anoikis，源自希腊语“无家可归”）。这一过程通过清除错位细胞来维持组织稳态。肿瘤转移的进展通常涉及基质分离、局部侵袭、迁移、循环中存活、外渗和次级部位定植等步骤。恶性细胞获得失巢凋亡抵抗是发生转移的先决条件。因此，失巢凋亡抵抗在肿瘤发生和进展中的作用日益受到关注。例如，基质中的胶原IV/整合素相互作用通过B细胞淋巴瘤（B-cell lymphoma, BCL）家族蛋白激活失巢凋亡抵抗，为肝转移研究提供了重要线索。转录因子PLAG1介导的谷氨酸脱氢酶1（Glutamate Dehydrogenase 1, GDH1）上调通过CamKK2–AMPK信号通路诱导失巢凋亡抵抗，从而促进肺癌转移。基于失巢凋亡相关基因的临床预后模型已在多种癌症中得到验证。然而，这些基因对胃癌预后和腹膜转移的预测价值尚未得到系统研究。同时，肿瘤基质在恶性进展中的促进作用近来受到越来越多的关注。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的各种基质细胞被广泛认为直接影响邻近肿瘤细胞的恶性特征。特别是癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs），作为肿瘤基质的主要组成部分，与肿瘤细胞相互作用，常常诱导侵袭性表型，促进转移潜能和化疗耐药性。然而，关于CAF介导的另一种调控方式——凋亡抵抗的激活，目前知之甚少，值得进一步探索。
SRPX2（Sushi-repeat-containing protein X-linked 2）是一种硫酸软骨素蛋白聚糖，最初在白血病中被鉴定为E2A–PBX1的下游靶标。它参与大脑发育、语言处理和血管生成。在肿瘤组织和细胞中，SRPX2通过多种信号通路上调表达，并影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和化疗敏感性。最近的研究已经确定了调控失巢凋亡抵抗的分子通路，包括促进上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）的细胞粘附分子和生长因子。关键的下游通路，如粘着斑和PI3K/Akt，在抗凋亡和肿瘤增殖中发挥重要作用。尽管有研究表明SRPX2可以增加FAK磷酸化，但其在GC肿瘤微环境中激活CAFs的作用以及其在调控肿瘤细胞失巢凋亡抵抗中的具体机制仍需进一步研究。
在本研究中，我们利用来自TCGA和GEO数据库的GC队列，使用非负矩阵分解（Non-negative Matrix Factorization, NMF）对失巢凋亡相关差异表达基因进行了无监督聚类。使用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）构建了GC的预后模型。使用支持向量机（Support Vector Machine, SVM）和随机森林（Random Forest, RF）等机器学习算法筛选了与腹膜转移相关的关键基因，并建立了预测模型。最终，SRPX2被确定为GC预后和腹膜转移的重要生物标志物，为GC的治疗干预和抑制PM进展提供了潜在靶点。
材料与方法
数据获取与处理
从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库获取胃癌（GC）患者的转录组数据及相应临床信息。剔除生存时间≤0天或生存信息缺失的样本。为扩大数据集，使用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集GSE65801中32对GC和正常组织的表达谱进行差异基因筛选。此外，数据集GSE84426、GSE84433和GSE38749被纳入用于构建和验证预后风险模型。为研究GC中腹膜转移（PM）相关因素，获取了GSE15081数据集的测序数据，该数据集包括75例无PM患者和33例有PM患者，用于后续分析。整合了GSE163558和GSE183904的腹膜转移样本单细胞测序数据用于进一步分析。使用GeneCards数据库，以相关性评分>0.4为标准，筛选出506个潜在的失巢凋亡抵抗相关基因。使用“DESeq2”包进行差异表达分析，阈值设定为|log2FC| > 1且FDR <0.05。
细胞培养
GC细胞系AGS、HGC-27和MKN45购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection, ATCC），并在中山大学孙逸仙纪念医院胃肠肿瘤实验室保存。从新鲜的人正常癌旁组织和原发性肿瘤组织中分别分离出正常成纤维细胞（Normal Fibroblasts, NFs）和癌症相关成纤维细胞（CAFs）。GC细胞系在补充了10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的DMEM培养基中培养。分离的CAFs和NFs在成纤维细胞专用培养基中培养，该培养基补充了2.5% FBS和1%生长因子。所有细胞在37°C、5% CO2的湿润环境中培养。实验在细胞对数生长期进行。
患者标本与知情同意
从2023年6月至2024年6月，收集了在中山大学孙逸仙纪念医院接受胃癌切除术的6名患者的原发肿瘤组织和匹配的癌旁正常组织。所有患者均经临床诊断为胃癌，并经术后病理检查证实。其中3例诊断为同时性腹膜转移，另外3例无腹膜或远处转移。常规病理检查后剩余的标本保存在液氮中供后续研究使用。本研究经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准（SYSKY-2024-887-01），并遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。获得了所有患者的书面知情同意，授权将捐赠的样本及相关信息用于所有医学研究目的。
动物模型建立
所有动物护理和实验程序均经过中山大学机构动物护理和使用委员会（Sun Yat-sen University Institutional Animal Care and Use Committee, SYSU-IACUC-2024-002900）审查和批准，并遵守动物保护原则、福利指南、伦理标准以及国家关于实验动物福利的规定。购买五周龄雄性BALB/c裸鼠。在异种移植瘤模型中，将细胞悬浮在50 μL Matrigel/PBS混合物中。将总计1 × 106个MKN-45细胞与1 × 106个成纤维细胞（Vector组，n = 5；shSRPX2组，n = 5）混合后皮下注射到小鼠侧腹。在整个研究期间使用数字卡尺监测肿瘤体积和体重。肿瘤体积计算公式为：体积（mm3）=（长 × 宽2）/2。4周后，通过吸入异氟烷（氧气流量：0.3–0.5 L/min，异氟烷浓度：3%–4%）麻醉小鼠，并通过颈椎脱臼法处死。切除的肿瘤组织保存在-80°C用于后续免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）分析。为抑制IL-6信号，通过皮下注射悬浮在50 μL Matrigel/PBS中的1 × 106个MKN-45细胞和1 × 106个成纤维细胞（Vector组或OE-SRPX2组）的混合物建立异种移植模型。在OE-SRPX2 CAF共注射组中，小鼠分别接受托珠单抗（10 μg/g，Actemra, Genentech, n = 5）或IgG对照（10 μg/g, Sigma, n = 5）的腹腔注射。定期监测肿瘤体积和体重。使用上述相同方法麻醉小鼠并通过颈椎脱臼法处死，收集肿瘤组织用于进一步分析。在腹膜转移模型中，将表达荧光素酶-EGFP的MKN-45细胞与处理过的CAFs悬浮在50 μL Matrigel/PBS中，腹腔注射。使用IVIS成像系统监测转移情况。实验结束时，麻醉小鼠并通过颈椎脱臼法处死。解剖并收集腹部转移结节用于后续分析。
统计分析
使用GraphPad Prism 9.0进行统计分析。统计结果以至少三次独立实验的平均值±标准误（S.E.M.）或平均值±标准差（S.D.）表示。组间差异采用Student双尾t检验和单因素方差分析（One-way ANOVA）进行比较。使用Spearman相关分析评估组间相关性。P < 0.05被认为具有统计学显著性。*, P < 0.05; , P < 0.01;*, P < 0.001。
结果
失巢凋亡相关差异基因的鉴定及GC中的遗传变异景观
我们从GeneCards数据库中筛选了506个失巢凋亡相关基因（Anoikis-Related Genes, ARGs），选择标准为相关性评分>0.4。随后，使用“DESeq2”包，以|log FC| > 1和FDR <0.05为截断标准，从TCGA-STAD队列中鉴定出87个在肿瘤和正常样本间显著差异表达的ARGs。为进一步确保筛选准确性，我们基于相同标准，从GSE65801数据集的32对胃癌和正常组织测序数据中获得了2,265个差异基因。其中，鉴定出42个重叠的ARGs。体细胞突变分析显示，TCGA-STAD队列中134个（31.09%）样本发生了失巢凋亡相关因子的遗传改变，主要包括错义突变和移码缺失。此外，拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）分析表明，CNV在胃癌样本的差异表达ARGs中普遍存在，CLDN1、ETV4和LAMC2主要表现为扩增变异，而EZH2、EPHB6和SERPINB5则表现出显著的缺失频率。圈图显示了ARGs突变的具体染色体位置。因此，失巢凋亡相关基因有潜力作为GC的诊断生物标志物。
GC中失巢凋亡相关亚群的鉴定
为扩大预后研究的样本量，我们将TCGA-STAD队列和GSE84433数据集标准化并合并为一个ARG研究队列，用于后续研究。单变量COX分析显示，大多数差异表达的ARGs是显著的风险因素且彼此相关。其中，14个因子具有显著的预后价值，包括CLDN1、MMP11、EZH2、TIMP1、PBK、LAMC2、SERPINE1、THY1、TNFRSF12A、NOTCH3、ANGPTL4、PDGFRB、CDX2和CCDC80。为进一步识别失巢凋亡在GC中的潜在机制，我们使用非负矩阵分解（NMF）算法，基于14个预后相关ARGs，在研究队列A的GC患者样本中识别特征亚群。默认使用“brunet”算法，根据共表型相关性选择最佳聚类数。研究队列A被分为A簇和B簇，主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）和t分布随机邻域嵌入（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding, t-SNE）图表明特征亚群分化良好且聚类明显。Kaplan-Meier生存曲线显示，A簇的预后显著优于B簇。随后，我们对不同亚型间的14个预后相关ARGs进行了差异分析。如图所示，失巢凋亡抵抗相关基因如MMP11、TIMP1、SERPINE1、THY1、TNFRSF12A、NOTCH3、ANGPTL4、PDGFRB和CCDC80在A簇中显著上调。热图显示了不同亚簇中预后相关ARGs的表达和临床特征。
失巢凋亡特征亚簇间的免疫特征和功能分析
此外，我们比较了不同亚簇的免疫表型特征。A簇中活化B细胞、活化CD8+T细胞、巨噬细胞和NK细胞的浸润丰度显著高于B簇。因此，A亚型的不良预后可能与免疫炎症微环境有关。为进一步探索不同亚型的潜在生物学功能障碍，我们对两种亚型进行了基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）。GSVA显示，与B簇相比，A簇中细胞粘附分子（Cell Adhesion Molecules, CAMs）、粘着斑和ECM受体相互作用等通路显著富集。GSEA分析中富集的通路再次验证了A簇中相关通路的富集。因此，这些通路的富集可能与不良预后和失巢凋亡抵抗的激活机制有关。这为我们后续的下游机制探索提供了方向。
加权基因共表达网络的构建及失巢凋亡特征模块的识别
为更准确地识别与胃癌进展相关的失巢凋亡特征基因，我们首先对不同亚型间进行了差异表达分析，共获得1,344个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。随后，基于这些DEGs，利用ARG研究队列的表达谱构建了加权基因共表达网络。经过样本聚类排除异常样本后，选择软阈值功率β = 11。然后转换拓扑重叠矩阵，并使用平均链接层次聚类生成树状图，合并切割高度为0.2，最小模块大小为60。此过程产生了五个共表达模块：黄色、棕色、蓝色、青绿色和灰色，其中灰色模块包含所有未分配的基因。热图分析显示，蓝色模块与A亚型特征显著相关（R = 0.54, p = 7e?57）。模块成员（Module Membership, MM）与基因显著性（Gene Significance, GS）的散点图进一步证实了蓝色模块内的强相关性（cor = 0.75, p = 8.6e?32）。因此，选择蓝色模块中的169个基因用于后续分析。
失巢凋亡相关预后风险模型的构建与验证
为阐明失巢凋亡特征基因在胃癌（GC）中的预后价值，我们基于先前分析中鉴定出的169个显著相关的模块基因构建了预后风险评分模型。首先将ARG研究队列按7:3的比例随机分为内部训练集（n = 493）和内部验证集（n = 211）。此外，将GSE84426和GSE38749数据集标准化合并作为外部验证集（n = 91）。通过LASSO分析筛选最佳预后特征因子。基于最小偏似然偏差，选择了六个最佳因子——HTRA1、HEYL、SRPX2、LBH、ITGAV和PLAT——进行多变量Cox分析以构建预后风险模型。如图所示，所有六个关键因子均被确定为高风险因子。风险评分计算公式如下：
风险评分 = (0.0714838946470207 × HTRA1) + (0.156841470971057 × HEYL) + (0.0427683260769306 × SRPX2) + (0.105640856086873 × LBH) + (0.0835692421728162 × ITGAV) + (0.117071070606207 × PLAT)
为评估模型性能，将内部训练集、内部验证集和外部验证集中的样本根据中位风险评分分为高风险组和低风险组。Kaplan–Meier生存曲线显示，高风险组在内部训练集、内部验证集和外部验证集中的总生存期（Overall Survival, OS）均显著缩短。内部训练集1年、3年和5年ROC曲线的曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）值分别为0.613、0.639和0.654。内部验证集（0.652, 0.664, 0.675）和外部验证集（0.661, 0.680, 0.681）的AUC值进一步证实了模型的准确性。热图表明模型风险因子在训练集高风险组中显著过表达。散点图显示高风险患者生存概率较低且死亡较早，这一趋势在验证集中也一致观察到。这些结果表明，失巢凋亡相关风险模型是GC患者预后预测的有效工具。
预后模型与临床病理特征的相关性分析
为研究失巢凋亡相关预后模型与胃癌（GC）患者临床病理特征的关系，我们首先汇编并筛选了训练集和验证集中患者的临床病理信息用于后续分析。进行单变量和多变量Cox回归分析以评估风险评分和临床特征对GC患者的预后影响。结果表明，年龄、N分期和风险评分均是独立的预后因素。按不同临床特征分层的风险评分箱线图显示，不同T分期和N分期的组间风险评分存在显著差异。为提供直观的临床预后评估工具，我们构建了一个整合了年龄、性别、T分期、N分期和风险评分的多变量列线图。校准曲线表明列线图能准确预测长期生存概率，而累积风险图表明高风险组的累积风险更高。决策曲线分析（Decision Curve Analysis, DCA）用于评估列线图的临床效用。结果显示，在1年、3年和5年预测中，列线图在各种阈值概率下提供了更高的净临床收益，证实了其强大的临床应用潜力。
基于机器学习的胃癌腹膜转移诊断模型的开发
先前研究表明，胃癌细胞中失巢凋亡抵抗的激活与腹膜转移呈正相关。为探索GC患者腹膜转移的潜在生物标志物是否与失巢凋亡抵抗的激活相关，我们分析了GSE15081数据集的测序数据，该数据集包括33例腹膜复发（Peritoneal Recurrence, PR）患者和75例无腹膜复发（Non-Peritoneal Recurrence, NPR）患者。差异表达分析鉴定出18个差异表达基因（|log2FC| > 0, p < 0.05）。随后，使用SVM-RFE和随机森林（RF）算法基于这些差异表达基因构建腹膜转移进展的预测模型。性能比较显示，使用RF算法拟合的模型获得了更高的预测准确性。因此，采用RF算法拟合与腹膜复发相关的临床特征，并对相关基因的重要性进行排序。使用重要性评分阈值>2，筛选出九个特征基因。为增强模型的临床适用性，开发了列线图。结果显示，当疾病特征基因的总分达到280分时，GC患者发生腹膜转移的风险比高达90%。校准曲线表明模型具有很高的准确性，决策曲线分析（DCA）表明在广泛的阈值概率范围内具有显著的临床净收益。临床影响曲线（Clinical Impact Curve, CIC）显示，当阈值概率超过0.6时，预测风险与实际事件高度一致，表明模型具有优异的临床预测性能。值得注意的是，SRPX2在预后模型中作为风险因子，同时在腹膜转移模型中作为特征基因被一致鉴定出来。因此我们假设，SRPX2的高表达可能与GC细胞失巢凋亡抵抗的激活有关，从而导致腹膜转移和不良预后。
SRPX2在GC组织中高表达并与TME中CAF浸润相关
泛癌分析显示，SRPX2在多种肿瘤类型中显著过表达。为进一步研究SRPX2在胃癌（GC）发展和腹膜转移中的作用，我们分析了TCGA数据集中GC组织的SRPX2表达，观察到SRPX2显著上调。对配对GC样本的额外分析证实了这一发现，显示肿瘤组织中的SRPX2水平明显高于癌旁正常组织。我们还对临床样本进行了免疫组织化学（IHC）染色，包括有腹膜转移的GC组织、无腹膜转移的GC组织以及癌旁正常组织。有或无腹膜转移的GC组织的染色强度和阳性染色面积均显著高于正常组织，其中腹膜转移样本的强度最强。在合并数据集中，高SRPX2表达与GC患者较差的总生存期（OS）相关。ROC曲线分析表明，SRPX2表达对长期生存具有强大的预测能力（AUC：1年0.590，3年0.601，5年0.753）。使用Kaplan–Meier Plotter数据库进行的生存分析进一步证实，高SRPX2表达与较差的首
