SCN4A新变异c.611C>T的功能研究：日本肌无力患者中Nav1.4通道功能保留性突变的发现与致病机制探讨

《Frontiers in Biophysics》：Functional study of a novel SCN4A variant c.611C>T identified in a Japanese patient with myasthenia

本文报道了一例日本肌无力患者携带SCN4A基因新型杂合变异c.611C>T的功能研究成果。该变异通过引起p.A204V错义突变（39%）和外显子4-5剪接异常（p.A204Vfs*94，4%）导致Nav1.4通道蛋白改变。值得注意的是，电生理学检测显示p.A204V通道的膜靶向能力和离子通道功能与野生型（WT）无显著差异，细胞毒性实验亦未发现变异蛋白引发异常细胞死亡。研究首次揭示该变异可能通过单倍体不足（haploinsufficiency）机制导致迟发性肌无力，为SCN4A相关骨骼肌通道病（skeletal muscle channelopathies）的基因型-表型关联提供了新视角。

　　

引言

骨骼肌通道病是由调控骨骼肌兴奋性的电压门控离子通道基因突变引起的遗传性疾病。其中，编码电压门控钠通道Nav1.4的SCN4A基因是重要致病基因，其变异与多种临床表型相关，包括钠通道肌强直（SCM）、先天性副肌强直（PMC）、高钾性周期性麻痹（HyperPP）和低钾性周期性麻痹2型（HypoPP2）。近年来研究发现，SCN4A功能缺失型变异与先天性肌无力综合征（CMS）和/或先天性肌病（CM）相关，而影响剪接的SCN4A变异极为罕见。

病例展示

本研究对象为一名54岁日本女性患者，自47岁起出现四肢严重疲劳、复视和双侧眼睑下垂等症状，症状在傍晚加重，具有波动性，休息和冷敷可缓解。神经系统检查显示双侧眼睑下垂，但其他颅神经完好，四肢肌力5级。患者最初被临床诊断为血清阴性重症肌无力（MG），但免疫抑制治疗无效。值得注意的是，其儿子出现类似但较轻的症状，且 prolonged exercise test（延长运动试验）呈阳性，提示可能存在家族性周期性麻痹。

遗传学分析

全外显子测序发现患者携带SCN4A基因c.611C>T杂合变异，该变异位于外显子4的3‘端。利用SIFT、PolyPhen2、PROVEAN和CADD等in silico（计算机模拟）致病性预测工具均判定该变异为“有害”。同时，剪接预测工具SpliceAI和Pangolin也提示该变异可能影响RNA剪接。

剪接异构体分析

为验证变异后果，研究人员对患者骨骼肌样本进行RNA分析。结果显示，SCN4A转录本中存在三种类型：正常转录本（57%）、c.611C>T错义突变（p.A204V，39%）和c.611_612缺失导致的剪接异常（p.A204Vfs*94，4%）。p.A204V位于Nav1.4蛋白第I结构域第3节段的细胞外侧，在人类SCN基因家族和跨物种中高度保守。

膜蛋白靶向效率

为探究p.A204V对Nav1.4功能的影响，首先通过Cy3（花青素3）荧光标记法检测突变通道的膜靶向效率。实验发现，p.A204V Nav1.4的膜靶向效率（F_Cy3/F_mTq2比值）与野生型（WT）无统计学差异，表明该错义突变不影响通道蛋白的折叠和膜表达。

电生理学分析

通过全细胞膜片钳技术系统评估p.A204V Nav1.4的通道功能。电压依赖性激活（V_1/2= -10.5 ± 2.1 mV）和稳态快失活（V_1/2= -50.6 ± 1.4 mV）曲线与WT通道相似。虽然在-50 mV时p.A204V的快失活动力学比WT快1.5倍，但整体通道特性仍呈WT样，难以解释患者的临床症状。此外，稳态慢失活参数也无显著差异。

细胞毒性实验

鉴于p.A204Vfs94截短蛋白可能具有细胞毒性，研究团队构建了多西环素（Dox）诱导表达的HEK293T稳定细胞系。实验发现，即使在高表达条件下，p.A204Vfs94 Nav1.4也未能诱发显著细胞死亡，而全长Nav1.4（含p.F1519S孔道阻断突变）则表现出明显的细胞毒性。

讨论

本研究首次报道了SCN4A c.611C>T变异导致的双重分子机制：主要产生功能保留的p.A204V错义突变，次要引起截短蛋白p.A204Vfs*94。尽管变异蛋白本身未表现出经典通道功能异常或细胞毒性，但研究者提出单倍体不足（haploinsufficiency）可能是潜在致病机制。即剪接异常导致的无义介导的mRNA降解（NMD）和内质网相关降解（ERAD）可能降低功能性Nav1.4蛋白的总量，这与Scna4a单倍体不足小鼠模型表现出的潜伏性肌无力表型相符。

结论

本研究通过多功能实验平台排除了SCN4A c.611C>T变异通过功能获得性或细胞毒性致病的可能性，提出了单倍体不足这一新型致病机制，拓展了对SCN4A相关疾病基因型-表型关联的认知。研究强调了对非典型神经肌肉表型患者进行综合功能验证的重要性，为未来利用诱导多能干细胞（iPSC）分化骨骼肌细胞等更接近临床的模型研究奠定了基础。