基于家蚕-杆状病毒表达系统的GI型诺如病毒病毒样颗粒结构稳定性差异及基因型特异性纯化策略研究

《Frontiers in Microbiology》：Structural and stability differences among GI norovirus virus-like particles produced in silkworm–baculovirus expression vector system

本综述系统阐述了利用家蚕-杆状病毒表达系统（Silkworm-BEVS）生产GI型诺如病毒（NoV）病毒样颗粒（VLPs）时面临的基因型特异性挑战。研究通过优化提取缓冲液pH值（6.0-8.0）、蔗糖垫超速离心（30%/60%）和阴离子交换色谱（如CIMmultus? QA柱）等纯化工艺，成功获得GI.2、GI.3、GI.4基因型VLPs。采用动态光散射（DLS）、尺寸排阻色谱（SEC）、透射电镜（TEM）等技术证实VLPs粒径为30-40 nm，且保留猪胃黏蛋白（PGM）结合活性。稳定性分析揭示基因型依赖性差异：GI.4在pH<5.0时易聚集，GI.2在pH 9.0可逆转化为管状结构；差示扫描荧光法（DSF）显示热稳定性为GI.3（72.30°C）< GI.2（74.75°C）< GI.4（76.78°C）。本研究为多价NoV疫苗设计提供了关键理论依据。

　　

引言

诺如病毒（NoV）是全球急性胃肠炎的主要病原体，每年导致约18.5万-21.9万死亡病例，尤其影响婴幼儿、老年人及中低收入国家人群。其经济负担沉重，仅美国年损失超60亿美元。目前尚无获批疫苗或特效抗病毒药物。NoV属于杯状病毒科，为无包膜单股正链RNA病毒，遗传多样性显著，分为10个基因群（GI-GX），其中GI和GII最为常见。病毒衣壳由主要结构蛋白VP1（约60 kDa）和次要蛋白VP2组成，VP1包含壳区（S）和突出区（P），P区进一步分为P1和P2亚域，后者含有宿主受体血型组抗原（HBGAs）结合位点。病毒样颗粒（VLPs）作为缺乏基因组的空衣壳结构，是疫苗研发的重要工具。然而，现有研究多集中于GI.1和GII.4基因型，其他GI基因型VLPs的生产和特性尚不明确。家蚕-杆状病毒表达系统（Silkworm-BEVS）虽能高效表达异源蛋白，但前期研究表明GI基因型VLPs存在溶解度低、颗粒异质性等问题。本研究旨在通过优化纯化策略，系统评估四种GI基因型（GI.2、GI.3、GI.4、GI.6）VLPs的结构与稳定性差异。

材料与方法

采用缺失六种非必需基因（如^Δegt、^Δchitinase）的重组杆状病毒（BmNPV T3^Δsix-gene）在家蚕蛹中表达VP1蛋白。通过比较不同pH值（6.0、7.0、8.0）的磷酸钠缓冲液评估VP1溶解度。纯化流程包括：蔗糖垫超速离心（30%/60%双层）、阴离子交换色谱（CIMmultus? QA柱或HiTrap? Q HP柱）。VLPs表征采用动态光散射（DLS）分析粒径、尺寸排阻色谱（SEC）评估均一性（通过拖尾因子TF量化）、透射电镜（TEM）观察形态。功能验证通过PGM结合实验检测HBGAs模拟物结合活性。稳定性测试包括pH稳定性（透析至pH 3.0-9.0缓冲液后DLS检测）和热稳定性（差示扫描荧光法DSF测定熔解温度T_m）。

结果

提取pH对VP1溶解度的影响：GI.2在pH 6.0溶解度最高，GI.4适于pH 7.0，GI.3在所有pH下溶解度均约50%，GI.6完全不溶而被排除后续实验。蔗糖垫离心显示GI.2和GI.3 VP1富集于30%/60%界面（Fr.3），而GI.4主要分布于30%蔗糖层（Fr.2），提示其颗粒易解离。阴离子交换色谱中， monolithic柱较传统HiTrap?柱显著提高纯度，GI.3需采用阶梯洗脱（125 mM→450 mM NaCl）避免降解。VLPs表征：DLS显示平均流体力学直径D₅₀为GI.2（24.74 nm）、GI.3（34.84 nm）、GI.4（26.86 nm）。SEC谱呈现基因型特异性拖尾（GI.4最显著），表明组装异质性。TEM证实30-40 nm颗粒形成，但GI.4存在未组装结构。PGM结合实验表明所有基因型均保留受体结合活性。稳定性方面：pH稳定性上，GI.2在pH 4.0-8.0稳定，pH 3.0聚集，pH 9.0可逆转化为管状结构；GI.3在pH 3.0-5.0部分解离；GI.4在pH<5.0剧烈聚集（>500 nm）。热稳定性顺序为GI.4（76.78°C）> GI.2（74.75°C）> GI.3（72.30°C），且SEC纯化后VP1的T_m均高于70°C，提示组装态热稳定性高。

讨论

本研究首次建立GI基因型VLPs的针对性纯化平台，揭示其稳定性与GII基因型的本质差异。溶解度差异可能与VP1折叠路径、二聚体稳定性及宿主因子（如金属离子、VP2）相关，例如GI.4对低pH敏感性与其在Silkworm-BEVS中的修饰有关。颗粒异质性（如SEC拖尾）反映部分基因型（GI.4）易解离为二聚体或寡聚体，需通过二硫键突变等工程策略稳定组装。pH稳定性差异表明GI VLPs整体耐酸性弱于GII（如GII.4在pH 3.0-8.0稳定），而碱性条件下可逆结构转化（如GI.2管状组装）为疫苗制剂优化提供新思路。尽管VLPs保留受体结合能力，但抗体检测灵敏度差异阻碍了亲和力精确比较。未来需重点解决GI.3和GI.6的溶解度难题，并评估免疫原性及交叉保护效力。

结论

通过基因型定制化纯化策略，本研究成功获得高纯度GI NoV VLPs，阐明其VP1在未组装状态的热力学不稳定性是生产瓶颈的核心原因。稳定性数据为多价疫苗的配方设计、储存条件及佐剂选择提供了关键参数。后续工作应聚焦于利用结构生物学手段解析GI VP1的组装机制，并通过动物实验验证其免疫保护潜力。