《International Journal for Parasitology》：NcROP24 loss attenuates
Neospora caninum virulence and alters rhoptry organization
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本研究针对新孢子虫(Neospora caninum)致病机制不清的问题，通过CRISPR/Cas9技术构建NcROP24基因敲除突变体(NcΔROP24)，发现该蛋白缺失可显著降低寄生虫在孕鼠模型中的垂直传播能力，改变宿主巨噬细胞的转录调控网络，揭示NcROP24作为棒状体效应蛋白在调控宿主-寄生虫互作中的关键作用，为牛新孢子虫病的疫苗研发提供新靶点。
在畜牧业领域，牛新孢子虫病(Neosporosis)犹如一个隐形杀手，每年造成全球范围内数十亿美元的经济损失。这种由专性细胞内寄生原虫——新孢子虫(Neospora caninum)引起的疾病，是导致奶牛流产和繁殖障碍的首要传染性病因。新孢子虫与著名的弓形虫(Toxoplasma gondii)同属顶复门(Apicomplexa)寄生虫，它们共享类似的入侵机制和细胞内寄生策略。然而，与新孢子虫相关的分子致病机制却远不如弓形虫研究得深入。
问题的核心在于新孢子虫如何成功地在宿主体内建立感染并逃避免疫清除。像许多顶复门寄生虫一样，新孢子虫依赖于一套高度特化的分泌器官——微线体(micronemes)、棒状体(rhoptries)和致密颗粒(dense granules)。其中，棒状体蛋白(ROPs)在寄生虫入侵宿主细胞的早期过程中发挥关键作用，它们像精准的分子武器，改造宿主细胞环境，压制免疫防御，为寄生虫创造安全的繁殖场所。尽管一些新孢子虫棒状体蛋白如NcROP2和NcROP40已被证明与毒力相关，但大多数棒状体蛋白的功能仍然是个谜。
在前期研究中，科学家们注意到一个有趣的现象：在高毒力新孢子虫分离株中，一个名为NcROP24的棒状体蛋白表达水平显著升高。更复杂的是，新孢子虫基因组中竟然存在三个高度相似的NcROP24旁系同源基因(paralogs)，这引发了关于它们是否具有功能冗余或特异性作用的疑问。尽管转录组学数据表明这三个基因位点都有活性，但NcROP24在新孢子虫致病过程中的具体功能至今未知。
为解开这一谜团，由Rafael Amieva领导的研究团队在《International Journal for Parasitology》上发表了一项突破性研究，他们首次通过基因编辑技术揭示了NcROP24在新孢子虫毒力中的关键作用。研究表明，缺失NcROP24会显著削弱寄生虫的致病能力，改变棒状体结构，并重塑宿主细胞的转录程序，这些发现为理解新孢子虫致病机制提供了新视角，也为开发抗新孢子虫干预策略指明了新方向。
研究人员采用了几项关键技术展开研究：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统同时靶向三个NcROP24旁系同源基因，成功构建了NcROP24敲除突变体(NcΔROP24)；通过孕鼠模型评估寄生虫的体内毒力和垂直传播能力；采用牛单核来源巨噬细胞(BMDM)和牛滋养层细胞(F3)分析寄生虫的体外增殖特性；运用双RNA测序(dual RNA-seq)技术同时分析感染过程中宿主和寄生虫的转录组变化；借助免疫胶体金标记和透射电镜技术确定NcROP24的亚细胞定位。
研究结果从多个层面揭示了NcROP24的功能：
基因组分析确认了三个NcROP24旁系同源基因的存在。研究人员通过对高毒力分离株Nc-Spain7和低毒力分离株Nc-Spain1H进行基因组比对，证实了NCLIV_007450、NCLIV_068850和NCLIV_069590这三个位点确实存在，且在不同分离株中保持高度保守。RNA测序数据进一步显示，这三个位点在野生型寄生虫中均有转录活性，尽管表达水平存在差异。
NcROP24定位于棒状体周边区域。通过免疫胶体金标记和透射电镜观察，研究人员发现NcROP24主要分布在棒状体的外周区域，而不是棒状体核心或球部。这种定位特征提示NcROP24可能参与棒状体膜的组成或作为分子支架调控其他效应蛋白的分泌。
成功构建并验证了NcΔROP24敲除突变体。研究团队设计了一种巧妙的策略，针对三个NcROP24旁系同源基因的保守区域设计向导RNA，通过CRISPR/Cas9系统同时破坏所有三个基因拷贝。通过PCR、qPCR和免疫荧光等多种方法验证，确认获得了四个独立的NcΔROP24克隆，这些克隆中NcROP24蛋白表达完全缺失，且药物筛选标记DHFR-TS为单拷贝整合。
NcROP24缺失显著减弱寄生虫在孕鼠模型中的毒力。在BALB/c小鼠先天性新孢子虫病模型中，与感染野生型Nc-Spain7的母鼠相比，感染NcΔROP24的母鼠产下的后代存活率显著提高（约25%存活至产后30天，而野生型组全部死亡）， median生存时间延长（16天vs21-22天），母鼠脑内寄生虫负荷降低，临床症状减轻。血清学分析还显示，感染突变体的母鼠表现出更偏向Th1型的免疫反应（IgG1/IgG2a比率降低），这与有效的寄生虫控制相关。
NcΔROP24在巨噬细胞中复制受损，但对干扰素-γ(IFN-γ)的敏感性未改变。在牛单核来源巨噬细胞中，NcΔROP24在感染后期（48-72小时）显示明显的复制缺陷，而在牛滋养层细胞F3中则复制正常。当用不同浓度IFN-γ处理感染的巨噬细胞时，野生型和突变体寄生虫均显示剂量依赖性的生长抑制，且程度相当，表明NcROP24缺失不影响寄生虫对IFN-γ介导的免疫应答的敏感性，其复制缺陷可能与基础性降解途径的抵抗能力下降有关。
转录组分析揭示了NcROP24缺失对宿主-寄生虫互作的多层次影响。双RNA测序结果显示，NcΔROP24感染的巨噬细胞与野生型感染的细胞在基因表达谱上明显分离。特别值得注意的是，NcROP24缺失导致宿主细胞中与自噬(autophagy)、溶酶体生物发生和线粒体自噬(mitophagy)相关的基因表达下调，而与胆固醇稳态、脂肪酸代谢和应激反应相关的基因表达上调。转录因子活性分析显示，与应激适应和代谢重编程相关的转录因子（如EHF、NFATC4）活性增强，而与稳态维持和分化相关的转录因子（如ERG、PAX6）活性降低。
从寄生虫角度看，NcΔROP24突变体表现出组蛋白基因上调和其他毒力因子（如RDF2、ROP32、ROP40、GRA23）下调的转录特征，表明寄生虫可能向压力适应性状态转变，减少了攻击性增殖。
比较聚类分析揭示了NcROP24特异性调控的宿主通路。当将NcΔROP24与先前研究的NcΔROP2突变体进行比较时，研究人员发现两者均影响宿主细胞周期调控，但只有NcROP24缺失特异性下调了与细胞内运输、自噬和溶酶体活性相关的基因模块，这凸显了NcROP24在调控宿主降解途径中的独特作用。
综合所有实验结果，本研究得出以下核心结论：NcROP24是新孢子虫毒力的关键决定因子，其缺失会显著减弱寄生虫在体内的致病性和垂直传播能力。在分子水平上，NcROP24定位于棒状体周边，可能作为分子支架参与调控棒状体效应蛋白的分泌和功能。NcROP24的缺失导致寄生虫无法有效重编程宿主巨噬细胞的转录网络，特别是削弱了其对宿主降解途径（如自噬和线粒体自噬）的抑制能力，同时增强了宿主的代谢应激反应，最终创造了一个不利于寄生虫存活的环境。
这项研究的创新性在于首次系统阐明了NcROP24在新孢子虫致病机制中的关键作用，揭示了该蛋白通过调控宿主降解途径而影响寄生虫存活的新机制。不同于大多数研究关注的催化活性强的棒状体激酶，NcROP24作为一个可能缺乏典型催化活性的棒状体蛋白，通过非酶活方式影响宿主-寄生虫互作，这拓展了我们对顶复门寄生虫效应蛋白功能多样性的认识。
从应用角度看，NcROP24作为一个重要的毒力因子，可能成为抗新孢子虫药物或疫苗开发的新靶点。特别是考虑到NcΔROP24突变体在体内显示显著减毒但在体外培养中仍能存活的特点，提示其可能具有作为减毒活疫苗候选株的潜力。当然，这需要进一步在牛等自然宿主模型中验证其保护效果和安全性。
研究的讨论部分还指出了几个值得深入探索的方向：首先，需要明确NcROP24的具体分子功能——它是作为支架蛋白参与其他效应蛋白的组装，还是具有非典型酶活？其次，三个NcROP24旁系同源基因是否具有功能分工或冗余？此外，NcROP24如何与其他棒状体蛋白协同工作，以及它在不同宿主细胞类型中的功能特异性，都是未来研究的重要课题。
总体而言，这项研究不仅深化了我们对新孢子虫致病分子机制的理解，也为开发控制牛新孢子虫病的新策略提供了理论依据和实验基础。随着对NcROP24等功能分子机制的进一步解析，我们有望最终找到有效控制这种重要寄生虫病的突破口，减少其对全球畜牧业的危害。
