《Lab on a Chip》：Lymphatics-on-a-chip microphysiological system: engineering lymphatic structure and function in vitro
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这篇综述系统阐述了淋巴芯片（lymphatics-on-a-chip）微生理系统的前沿进展，该技术通过整合三维结构、流体流动和生物力学刺激，在体外精准重构了人类淋巴管的结构与功能。文章深入探讨了其背后的基础淋巴生物学与工程学原理，重点分析了该平台在疾病建模（如淋巴水肿、癌症、自身免疫病和神经系统疾病）和药物测试中的应用潜力，并展望了通过诱导多能干细胞（iPSC）整合、器官特异性定制及计算建模等未来方向，为淋巴相关疾病的机制研究和治疗策略开发提供了强大工具。
引言
淋巴系统在维持体液平衡、运输膳食脂肪和协调免疫细胞运输中扮演着关键角色。尽管其重要性日益凸显，但传统研究模型，如静态二维（2D）细胞培养和动物模型，在重现人类淋巴功能方面存在局限。近年来，微流体器官芯片技术的进步提供了仿生平台，能够整合三维结构、流体流动和生物力学刺激，与人类淋巴管内皮细胞（LEC）及支持细胞共同培养。这些淋巴芯片结构能够在生理和病理反应下忠实再现液体引流、连接重塑和细胞运输等动态行为。
淋巴生物学的基础原理
过去二十年的开创性发现重新定义了我们对淋巴生物学的理解。早期研究发现，肿瘤通过过度表达血管内皮生长因子C/D（VEGF-C/D）来利用淋巴管生成（lymphangiogenesis）促进转移。临床数据也支持这一点，表明肿瘤相关淋巴管密度（LVD）与实体瘤的淋巴结转移和较差生存率相关。阻断VEGF-C或其受体VEGFR-3（FLT4）可抑制小鼠的淋巴转移，确立了这些通路作为有前景的治疗靶点。这些发现，连同 prospero 同源框基因1（PROX1）的克隆以及第一个淋巴特异性标志物——淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1）、平足蛋白（PDPN）和VEGFR-3的鉴定，使得能够明确区分淋巴和血管内皮细胞。
发育起源与组织特异性异质性
LEC表达核心内皮标志物如VE-钙粘蛋白和CD31，但也表达独特的分子，包括LYVE-1、平足蛋白和转录因子PROX1，这些共同定义了淋巴特性。经典研究确定哺乳动物淋巴管主要起源于从主静脉出芽的PROX1+内皮细胞。然而，更近期的谱系追踪和单细胞分析揭示了额外的非静脉来源。无论起源如何，PROX1作为LEC命运的主调控因子。认识到这种发育异质性对于芯片上的器官特异性淋巴建模非常重要。
结构和功能特化
淋巴脉管系统形成一个单向运输网络。它始于盲端的初始淋巴毛细管，由单层橡树叶状LEC通过不连续的“纽扣样”连接构成。这些纽扣连接和重叠的内皮瓣膜作为初级阀门，允许液体和免疫细胞从间质进入。随着这些毛细管汇合成更大的收集淋巴管，内皮连接转变为连续的“拉链样”连接。收集淋巴管还具有管内瓣膜，并被淋巴肌细胞（LMC）包裹，产生节律性收缩以推动淋巴液向前。这种分层组织确保了从组织的高效吸收和通过淋巴结的单向运输。
淋巴连接和瓣膜发育的机械生物学调控
淋巴管对其环境中的机械力非常敏感。液体剪切应力、血管泵送引起的循环拉伸以及基质锚定力共同塑造LEC的表型。这些刺激的一个关键结果是调节初始淋巴管中的细胞间连接，以及引导收集淋巴管中单向淋巴流的瓣膜发生。
力驱动的淋巴连接特化和可塑性
淋巴内皮连接显示两种特征性组织状态——初始淋巴毛细管中的纽扣样连接和收集管中的拉链样连接。这些模式通过发育成熟产生，但在成体组织中仍保持动态可修改。发育特化由多种信号通路强化，这些通路稳定连接结构。除了发育调控，初始淋巴毛细管中的连接表现出显著的机械可塑性。连接可塑性也由炎症和生长因子信号塑造。
振荡流依赖的淋巴瓣膜形成机械转导
收集淋巴管依赖管内瓣膜实现单向流动，其发育受到液体流动诱导的机械转导的严格调控。遗传调控因子如PROX1、FOXC2、GATA2、整合素-α9和VEGFR3在瓣膜形成LEC中富集，但它们的激活需要振荡流。流动模式关键地塑造这一程序。下游，PROX1和FOXC2与剪切响应通路协同执行形态发生。机械传感器将这些流动诱导的剪切力转化为下游信号。
剪切激活的淋巴内皮重塑
LEC是高度机械敏感的。即使微小的压力梯度也能驱动间质液体进入初始淋巴管，产生极低的间质流速度和剪切应力。相比之下，收集淋巴管经历由内在收缩和骨骼肌活动产生的脉动流。开创性工作表明，LEC与间质流对齐并呈现网络样结构，表明机械力加上基质信号调控淋巴形态发生。更近期的研究表明，剪切应力在LEC与BEC中触发不同的反应。
淋巴系统的微流控和仿生工程策略
该领域的早期努力从成熟的血管芯片模型中汲取灵感，使其适应淋巴管的独特特征。然而，淋巴管在发育起源、超微结构、较低的剪切应力环境和作为单向吸收导管的功能等方面与血管有本质区别。过去十年，研究人员在捕捉这些区别方面取得了显著进展。
基于淋巴管生成的可灌注淋巴毛细管工程
Noo Li Jeon及其同事开创了一种紧密模仿体内出芽的仿生淋巴生成芯片模型。在他们的设备中，在存在促淋巴生成因子梯度的情况下，LEC从血管出芽并侵入基质，形成多细胞毛细管突起。值得注意的是，应用了从组织侧向淋巴通道的缓慢间质流以模拟液体引流。这种间质流被证明是一个关键的调节因子。研究发现，适当的流动和生长因子协同作用，体外出芽显示出天然淋巴管的标志。其他研究将这种协同概念扩展到双血管模型，观察到血管生成通过局部基质金属蛋白酶（MMP）分泌促进淋巴出芽，突出了两个血管床之间的交叉对话。
用于淋巴血管生成的基质和支架工程
细胞外基质（ECM）环境的选择是另一个关键的设计参数。LEC通常需要3D基质来形成管状结构。基质刚度、孔隙率和粘附配体组成都影响淋巴形态发生。研究表明，相对较软的水凝胶在提供VEGF-C时最适合LEC管形成，而较高的刚度会显著损害出芽。从工程角度看，调整支架刚度对于在芯片上构建淋巴网络至关重要。粘附信号是LEC形成3D结构所需的另一个因素。最近，颗粒水凝胶作为支持淋巴血管生成的支架被探索。
淋巴管连接表型和壁细胞覆盖的工程化
理解LEC如何响应细胞外信号调节其细胞间连接，以及壁细胞如何参与这一过程，对于模拟初始和收集淋巴功能都至关重要。开创了一个初始淋巴管模型，可以直接研究ECM组成如何影响内皮屏障特性。研究发现，在纯胶原蛋白I中，LEC形成相对通透的连接，而当纤连蛋白加入胶原支架时，LEC连接显著收紧。这一屏障增强是由整合素α5的激活介导的。在此基础上，引入了更结构逼真的淋巴段模型——淋巴管芯片，它通过结合LMC扩展了屏障调节。在流动条件下，LEC沿血管轴对齐，而LMC呈周向取向，重现了体内的原生组织模式。
淋巴芯片中剪切应力、间质流和机械负载的微流控控制
流体动力学的精细调节是淋巴芯片系统的一个定义性特征，因为LEC经历的剪切应力明显低于BEC。这些细胞还暴露于不同的流动环境——从周围组织吸收间质液，同时通过淋巴管腔运输液体。重现这些不同的剪切环境对于生理相关的淋巴模型至关重要。为了解决这一挑战，开发了一种多层微流体设备，允许同时控制血液、淋巴和间质流体压力，以模拟组织中的复杂流体动力学。在此基础上，开发了一种双通道淋巴管芯片，能够精确独立地控制管腔流、间质流、两者结合或静态条件。使用该系统，证明在VEGF-C存在下，间质流维持了不连续的、纽扣样连接和最小的出芽，反映了静止、高通透性初始淋巴管的表型。相比之下，管腔流或组合流在VEGF-A存在下诱导了强劲的出芽和更连续的、拉链样连接，模仿了主动重塑的收集管。互补的方法试图重现收集淋巴管的节律动力学。引入了无泵、重力驱动芯片，其中设备的周期性倾斜在LEC衬里的通道中产生振荡流。这种设计在健康条件下产生了约0.9 dyn cm-2的生理相关剪切应力，而较高的倾斜速率将剪切应力增加到6-7 dyn cm-2，模拟了病理应激水平。
当前淋巴芯片模型的工程局限性和生理差距
尽管在工程化淋巴结构和功能方面取得了显著进展，但天然淋巴管的一些定义性解剖和生理特征仍然难以重现。这些差距凸显了持续改进淋巴芯片微生理平台的必要性。
缺乏盲端初始淋巴结构
大多数现有系统产生可灌注的、连续的微血管，类似于血管毛细管，而不是原生初始淋巴管特有的盲端结构。这种盲端形态并非偶然；它实现了压力驱动、瓣膜介导的间质液和大分子摄取。其在体外的缺失限制了对原发性淋巴引流的精确建模。
收集淋巴管中瓣膜样形态发生的缺失
虽然当前平台可以重现出芽淋巴生成或血管生成样网络组装，但尚未有平台诱导导致收集淋巴管中瓣膜形成的形态发生序列。机械生物学触发器可以在体外应用，但瓣膜小叶的形成、鞍形几何结构和淋巴管组织等下游事件仍未重现。
纽扣样连接特化不完全重建
尽管几个系统证明了不连续VE-钙粘蛋白模式的部分出现，但真实的纽扣样连接仍然难以创建。关键的体内特征仅被部分重现。这些差异可能反映了不完全的机械生物学条件作用以及对驱动纽扣特化的分子程序的不完全理解。
淋巴芯片的疾病应用
淋巴功能障碍涉及多种疾病，从淋巴水肿和炎症性疾病到癌症转移和代谢综合征。通过在体外重现淋巴生理学的关键方面，淋巴芯片设备已成为模拟这些病理和测试潜在干预措施的有力工具。
淋巴水肿病理生理学建模
淋巴水肿的特征是由于淋巴引流受损导致的组织肿胀。微生理系统最近被用来模拟这种病理并揭示淋巴功能障碍的机制驱动因素。开发了一种3D淋巴管芯片系统，其中LEC重现了纽扣样VE-钙粘蛋白连接并支持类似于原生初始淋巴管的液体摄取。然而，在暴露于炎症细胞因子时，芯片揭示了由LEC边界的一种新型ROCK2-JAM-A复合物介导的病理性连接收紧。这种VE-钙粘蛋白的过度稳定阻碍了液体和蛋白质的进入，显著减少了引流。重要的是，ROCK抑制恢复了液体摄取，确定了ROCK2作为淋巴水肿的潜在治疗靶点。建立了人类初始淋巴初级瓣膜芯片，其中可以精确调节间质和管腔压力。他们发现，急性炎症会降解原纤维纤维并损害液体摄取，但皮质类固醇治疗逆转了这种效应。相比之下，慢性低度TNF-α暴露导致LEC凋亡和持续的连接破坏，导致瓣膜衰竭和过度渗漏——类似于晚期淋巴水肿的状况。
肿瘤-淋巴相互作用和转移
淋巴脉管系统在转移中起着核心作用，特别是肿瘤利用淋巴生成扩散到区域淋巴结。肿瘤分泌生长因子如VEGF-C和VEGF-D，这些因子扩展了肿瘤周围淋巴管并重塑了引流淋巴结。这些变化促进了肿瘤细胞在淋巴生态位中的内渗和存活。淋巴芯片提供了一种在受控条件下研究这些过程的独特方法。早期共培养模型表明，液体引流增强了乳腺癌细胞向淋巴管的侵袭，由CCR7-CCL21信号介导，支持了自身趋化性的概念。这一概念通过一个包含肿瘤细胞、成纤维细胞以及血液和淋巴管的仿生肿瘤微环境芯片得到了推进。间质流和成纤维细胞的存在促进了侵袭性肿瘤行为和淋巴重塑，强调了基质相互作用如何调节淋巴内皮。使用单通道微流体设备，证明乳腺癌相关成纤维细胞（CAF）破坏了淋巴管屏障功能。与侵袭性乳腺癌细胞共培养加剧了淋巴管渗漏并触发了IL-6分泌，这可能是淋巴转移的一种促转移机制。阻断IL-6信号部分恢复了淋巴屏障功能，提示了血管正常化策略的潜力。在后续研究中，发现肿瘤来源的成纤维细胞通过VEGF-C/D分泌和基质重塑 dramatically 增加了淋巴出芽和网络密度。在此平台基础上，揭示LEC分泌巨噬细胞迁移抑制因子（MIF），促进定向肿瘤细胞迁移和向糖酵解表型的代谢重编程。MIF的药理抑制减少了癌细胞的运动性，证明淋巴管可以通过旁分泌信号主动驱动肿瘤侵袭，而不仅仅是作为被动导管。
自身免疫和炎症性疾病
淋巴管是免疫系统的关键组成部分，促进树突状细胞（DC）和巨噬细胞从外周组织到淋巴结的运输，从而启动适应性免疫反应。在许多慢性炎症条件下，淋巴管重塑是一个标志性特征。淋巴芯片模型的进展推动了我们对炎症条件下免疫细胞迁移的理解。开发了一个微流体平台，重现了间质流、淋巴引流和免疫细胞在芯片上的招募。工程化的血管实现了生理相关的间质蛋白质和溶质引流，同时忠实地重现了淋巴-免疫相互作用。当在外周血单个核细胞（PBMC）被引入TNF-α诱导的炎症条件下时，淋巴芯片主动招募这些免疫细胞；值得注意的是，阻断趋化因子受体CXCR4和CCR7显著减少了PBMC浸润，证明了体外趋化因子驱动的免疫运输的稳健建模。对此进行了补充，引入了一个高通量微流体平台，忠实地重现了初始淋巴管在3D环境中的结构和功能，包括由CCR7-CCL21趋化因子梯度控制的DC迁移。在DC中CCR7表达升高或LEC经TNF-α预处理后，DC表现出增强的运动性和向淋巴通道的定向迁移。然而，慢性炎症导致DC过度进入，表明脱敏或屏障破坏。
神经和类淋巴疾病
在衰老和神经系统疾病领域，研究人员越来越关注脑膜淋巴管和类淋巴系统，它们共同介导脑脊液（CSF）和间质溶质从大脑的清除。类淋巴途径包括动脉周围CSF流入、星形胶质细胞水通道蛋白-4（AQP4）介导的间质交换和静脉周围流出，作为经典淋巴引流的胶质依赖类似物。其活动与硬脑膜上的脑膜淋巴管耦合，将类淋巴引流的CSF和溶质引导至深部颈淋巴结。任一通路的中断都会损害代谢废物清除，并与阿尔茨海默病、创伤性脑损伤和年龄相关的神经炎症有关。开发了一个神经血管单元（GVU）芯片：一个微流体平台，由两个平行通道嵌入3D水凝胶中，其中包含人类星形胶质细胞，形成与衬有人脑微血管内皮细胞的通道的AQP4极化终足。在炎症刺激下，系统显示从另一个无细胞通道引入的液体和Aβ(1–40)示踪剂的清除受损；即使在细胞裂解后，引流缺陷仍然存在，暗示了细胞依赖性和ECM介导的流体运输的作用。值得注意的是，炎症使AQP4去极化，突出了该通道定位的改变如何损害类淋巴功能。在此平台基础上，发现Aβ寡聚体，而非单体，引起显著的星形胶质细胞钙信号中断和AQP4的错误定位，损害了液体清除。证明高度磷酸化的tau诱导星形胶质细胞采用肥厚、超收缩表型，导致工程化血管的血管收缩和类淋巴清除减少。关键的是，使用blebbistatin药理抑制非肌肉肌球蛋白II逆转了星形胶质细胞的超收缩性，恢复了血管直径，并挽救了液体运输功能。
未来方向：迈向多尺度和人类相关的淋巴微生理系统
淋巴芯片领域正在迅速发展，但仍处于早期增长阶段，具有显著的创新潜力。有几个有前景的途径正在出现，以增强这些系统的生理相关性、可扩展性和分析能力。
iPSC衍生的淋巴类器官和合成发育程序
当前淋巴芯片模型的一个主要限制是依赖于原代LEC，这些细胞通常从新生儿或成人皮肤中分离，可能无法捕捉不同组织间淋巴管的分子和功能异质性。iPSC提供了LEC和淋巴类器官的可再生、患者特异性来源。开发了一种高效方案，使用转录因子ETV2和ETS2，并精确计时PROX1激活，将人类iPSC（hiPSC）分化为表达VEGFR3、LYVE-1和平足蛋白的LEC，其水平与成熟细胞相当。这些iPSC衍生的LEC可以组装成稳定的淋巴网络，并分泌淋巴分泌因子，支持其用于体外建模。然而，尽管表达了关键标志物，iPSC衍生的LEC通常表现出发育不成熟的谱系，功能成熟度部分。灌注和生物力学调节已显示显著改善iPSC衍生血管细胞的结构和代谢成熟。因此，在分化过程中加入生物物理刺激可能有助于稳定LEC身份并促进成体样功能。
器官特异性淋巴模型
淋巴管不仅被视为液体清除和免疫细胞运输的导管，而且越来越被认为是器官发育、稳态和组织修复的主动调节者，通过淋巴分泌信号。LEC分泌多种组织相互作用因子，这些因子塑造周围基质、上皮、免疫和血管细胞的身份和功能。因此在体外模拟这些环境依赖性相互作用对于重现器官特异性淋巴表型和增强器官芯片系统的生理保真度至关重要。通过将淋巴结构直接整合到器官特异性微生理平台中，研究人员可以探究LEC如何影响和响应其组织环境。一个领先的例子是开发的人类眼房水流出芯片，它使用双层微流体架构重建了小梁网（TM）和淋巴样的施莱姆管（SC）。该平台通过引导间质流经被TM包裹的SC内皮区室，重现了人类房水引流。在类固醇暴露下，该芯片重现了类固醇诱导性青光眼的标志性特征，包括受损的液体流出和增强的SC连接，由TM和SC细胞之间的ALK5-VEGFC信号轴介导。这项工作说明了新兴疾病表型需要异型相互作用，这些在单培养系统中无法捕捉，并将该平台定位为纳入多器官模型。
淋巴网络的计算和AI辅助设计
随着淋巴芯片系统变得越来越复杂，它们产生了丰富的、高维度的数据集，使用常规分析难以解释。这种复杂性为AI搭建实证实验和机械理解之间的桥梁提供了一个引人注目的机会。AI提供了强大的工具来处理淋巴微流体研究中典型的多变量扰动实验。例如，微流体方法已经使用进化算法来优化通道几何形状，以实现均匀的剪切应力或生理真实的流动分布。这样的方法可以适用于淋巴芯片，以定制模拟原生间质流或淋巴推进动力学的微通道网络。将AI应用于血管网络的一个里程碑式进展是开发了血管网络质量指数（VNQI），该指数使用监督机器学习和链式神经网络架构。该指数将复杂的血管形态压缩成一个单一的预测指标，与功能性氧运输密切相关——仅优于更简单的形态学测量。应用于淋巴管，一个类似的指数可以根据瓣膜密度、收缩行为和连接通透性等特征来量化网络在液体清除、免疫细胞运输或屏障完整性方面的效率。
人类淋巴微生理平台的验证标准
建立稳健的验证标准对于确保人类淋巴芯片准确重现原生血管的身份、结构和功能至关重要。验证应从确认分子身份和成熟度开始，包括规范淋巴标志物和连接蛋白的表达，以及表示发育进展的瓣膜相关调节因子。结构保真度可以通过成像纽扣样与拉链样连接、橡树叶状LEC重叠和维持组织附着的锚丝类似物来评估。功能验证应证明生理相关的溶质和大分子运输，通过示踪剂摄取和尺寸选择性通透性测定进行量化。机械生物学验证涉及确认流动依赖性行为。免疫相关性可以通过评估CCR7依赖性DC和T细胞向CCL21梯度的跨迁移，以及测试在TNF-α或IL-1β刺激下细胞因子诱导的屏障调节来建立。药理学扰动提供了进一步的功能基准。最后，应报告针对人类数据的定量基准测试，并附上清晰的效应大小和缩放假设，以促进可重复性和跨平台比较。
