《Advanced Science》：TP53BP2 Promotes Placental Autophagy and Preeclampsia via G9a and DNMT1 Cooperatively Modulating E2F1
1 引言
子痫前期（Preeclampsia, PE）是一种影响3%-7%妊娠的严重妊娠期并发症，是全球范围内导致孕产妇和胎儿发病及死亡的主要原因之一。根据发病时间，PE可分为早发型（妊娠34周前）和晚发型。早发型PE病情更为严重，以血压升高和蛋白尿为特征，且无法完全预防。滋养细胞侵袭不足、子宫螺旋动脉重铸障碍、胎盘功能障碍和内皮功能紊乱是早发型PE的主要病理特征。
自噬（Autophagy）是一种基本的生物过程，负责细胞成分的降解和循环利用。在妊娠早期，自噬在胚胎发生和正常胚胎发育中扮演关键角色。然而，在缺氧条件下，自噬会加速滋养细胞衰老，加剧其功能障碍。临床研究表明，LC3B介导的自噬在PE发病机制中发挥作用。PE孕妇胎盘及缺氧条件下的滋养细胞中自噬水平上调，提示抑制自噬可能成为PE的潜在治疗策略。然而，自噬在PE滋养细胞中的确切作用及其触发因素尚不清楚。
肿瘤抑制蛋白p53结合蛋白2（TP53BP2）基因编码的蛋白在调节细胞凋亡中起主要作用。内源性TP53BP2具有损伤诱导性，可调节涉及多种细胞功能的生理损伤反应通路。近期研究发现，TP53BP2在多种肿瘤中过表达，是肿瘤发生和发展的关键因子。此外，TP53BP2通过其N端结构域（与ATG12和LC3具有高度结构相似性）调控自噬。研究表明，TP53BP2在低浓度gp120下抑制自噬，而在高浓度gp120下诱导自噬，提示其调控自噬具有浓度依赖性。鉴于滋养细胞侵袭受损和螺旋动脉重铸不全是PE的主要原因，TP53BP2的异常表达和双重功能使其可能通过调控自噬参与PE发病。
胎盘形成过程中的异常DNA甲基化是与PE相关的最重要表观遗传因素。组蛋白修饰（如乙酰化）的改变也可导致PE发生。基因表达受DNA甲基化标记或转录因子结合位点等多种因素调控。在组蛋白修饰中，组蛋白甲基化是一种复杂的表观遗传机制，可通过改变染色体结构激活或抑制靶基因转录。DNA甲基化通过抑制基因转录调控基因表达，同时修饰染色质结构并与其他表观遗传修饰相互作用，实现更复杂的基因表达调控。在哺乳动物中，体细胞DNA甲基化模式主要由DNMT1活性决定。DNMT1与G9a之间的直接相互作用被认为在DNA复制过程中协调DNA甲基化和H3K9甲基化。
转录因子E2F1是E2F家族成员，参与细胞周期进程、细胞分化和DNA修复的调控。证据表明，E2F1和/或E2F2与CpG岛的特异性结合通过核小体耗竭保护基因免受从头DNA甲基化。此外，在乳腺癌中，E2F1表达增加和E2F1结合基序的CpG羟甲基化共同诱导ESRP1表达。寻找异常的DNA（低/高）甲基化可能是发现与PE相关的新标志物、预测和理解PE发展的合理途径。
2 方法与材料
本研究收集了2017年至2021年间在宁夏医科大学总医院接受剖宫产的85例孕妇胎盘组织。PE定义为妊娠20周后，两次测量（间隔至少6小时）收缩压（SBP）≥140 mmHg和舒张压（DBP）≥90 mmHg，并伴有蛋白尿（≥0.3 g/24 h）。非PE妊娠志愿者（n=40）的胎盘作为对照。PE妊娠组（n=45）胎盘来自早发型PE（<34周）孕妇。排除标准包括多胎妊娠、胎儿先天性畸形或染色体异常、近期感染、抗磷脂抗体阳性、创伤、妊娠期药物或酒精滥用、妊娠20周前高血压、有PE病史的血栓形成倾向、抗凝/抗聚集治疗史、吸烟以及产科检查数据不完整。
动物实验使用斯泼累格·多雷（Sprague-Dawley, SD）大鼠（13-14周龄）。通过手术诱导子宫灌注压降低（RUPP）建立PE模型。在妊娠第14天（GD14），大鼠在戊巴比妥麻醉下接受RUPP手术。简言之，切开腹腔暴露腹主动脉下端，在髂动脉分叉上方放置银夹（0.203 mm）使主动脉血流减少约40%。同时在子宫弓的卵巢端用银夹（0.100 mm）减少双侧子宫动脉的卵巢侧支循环程度。假手术组接受相同操作但不放置银夹。构建携带TP53BP2短发夹RNA（shRNA）、DNMT1 shRNA和G9a shRNA的重组腺相关病毒（AAV）血清型9载体，或携带阴性对照（AAV-shNC）的载体，将其注射入胎盘。在GD20处死大鼠，取出胎仔称重，胎盘保存于-80°C备用。
细胞实验使用HTR-8/SVneo和JEG-3细胞系。细胞在含10%胎牛血清（FBS）和抗生素-抗真菌溶液的RPMI-1640或Ham's F-12培养基中，于37°C、5% CO2条件下培养。为模拟严重缺氧，细胞在1% O2、5% CO2条件下培养48小时。使用重组腺病毒载体进行TP53BP2、DNMT1、E2F1和G9a的过表达，或使用慢病毒载体进行相应基因的敲低。
3 结果
3.1 TP53BP2在PE胎盘滋养细胞中的鉴定与验证
为阐明早发型PE胎盘滋养细胞自噬的分子机制，研究人员通过RNA测序（RNA-seq）比较了早发型PE孕妇与非PE孕妇胎盘组织中自噬相关差异表达基因（DEGs）。功能相关基因主要富集在自噬相关信号通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt、AMPK和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路。聚类热图显示了PE胎盘自噬相关信号通路中前20个DEGs，其中TP53BP2是最强的诱导因子。与非PE孕妇相比，TP53BP2在PE孕妇胎盘中的表达显著上调。免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色进一步证实了TP53BP2在PE妊娠滋养细胞中的上调。
为研究TP53BP2的功能，研究人员在HTR8/Svneo和JEG-3细胞中通过转染Ad-TP53BP2或三种独立的sh-TP53BP2构建体进行TP53BP2的过表达和敲低。结果显示，转染Ad-TP53BP2后，TP53BP2的mRNA和蛋白水平显著增加。在三种独立的sh-TP53BP2构建体中，sh-TP53BP2 (#3)在两种细胞系中均表现出最高的敲低效率，因此后续实验均使用此构建体。透射电子显微镜（TEM）结果显示，转染Ad-TP53BP2的滋养细胞中自噬体和自噬溶酶体形成增加，而转染sh-TP53BP2则出现相反效果。使用串联荧光GFP-RFP-LC3的自噬流检测显示，转染sh-TP53BP2的滋养细胞中总自噬体和自噬溶酶体形成减少。Western blotting分析证实了TP53BP2对缺氧条件下HTR8/SVneo和JEG-3细胞中LC3B-II和p62水平的影响。这些结果表明，TP53BP2上调可增加PE胎盘中的滋养细胞自噬。
3.2 TP53BP2敲低通过减少自噬缓解大鼠PE进展
基于体外研究结果，研究人员通过在GD14诱导大鼠RUPP建立PE模型，以研究TP53BP2的作用。使用携带TP53BP2 shRNA（AAV-shTP53BP2）的重组AAV9载体敲低PE大鼠的TP53BP2，导致血压降低、蛋白尿减少和胎儿体重增加。苏木精-伊红（H&E）染色也显示该大鼠模型中蜕膜细胞的水样变性和纤维蛋白沉积减少。此外，TP53BP2下调的PE大鼠胎盘显示LC3B-II表达降低和p62表达增加。免疫荧光染色和IHC染色结果一致。这些结果表明，TP53BP2敲低可减弱PE大鼠胎盘滋养细胞的自噬。
3.3 TP53BP2通过调控Beclin-1表达增强滋养细胞自噬
为探究自噬涉及的分子，研究人员对TP53BP2敲低的HTR8/SVneo细胞进行了RNA-seq。结果显示1046个分子上调和1035个分子下调。基因本体（GO）分析表明这些分子参与自噬、ATP结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、mTOR信号、HIF1信号通路和AMPK信号。qRT-PCR检测前10个下调基因的水平，结果显示自噬关键标志物Beclin-1在PE大鼠胎盘中的水平显著降低。
为确认Beclin-1在TP53BP2诱导的自噬中的作用，研究人员构建了三种独立的sh-Beclin-1并转导至HTR8/SVneo和JEG-3细胞。结果显示，转导sh-Beclin-1 (#1)后，Beclin-1的mRNA和蛋白表达水平显著降低。共转染sh-Beclin-1和Ad-TP53BP2导致HTR8/SVneo和JEG-3细胞中LC3B-II水平降低和p62表达增加。Bcl-2与自噬启动子Beclin-1相互作用。既往研究表明，Beclin-1从Bcl-2-Beclin-1复合物中释放启动了TP53BP2诱导的自噬。本研究探讨了Bcl-2与Beclin-1的BH3结构域结合在TP53BP2诱导的滋养细胞自噬中的作用。CoIP显示，在缺氧条件下，HTR8/SVneo和JEG-3细胞中TP53BP2与Bcl-2的相互作用增加，而Beclin-1与Bcl-2的相互作用被破坏。相反，TP53BP2敲低增加了Beclin-1与Bcl-2的相互作用。这些结果表明，TP53BP2敲低通过降低Beclin-1表达和促进Beclin-1与Bcl-2的相互作用来抑制滋养细胞自噬。
3.4 TP53BP2与PE的临床病理特征相关
为探讨TP53BP2在PE进展中的临床意义，研究人员收集了85例早发型PE妊娠（<34周；n=45）和非PE妊娠（n=40）的胎盘。两组在孕产妇年龄或胎儿性别上无显著差异。然而，PE妊娠组的SBP、DBP和蛋白尿显著升高。此外，PE妊娠组的孕产妇体重指数（BMI）显著高于非PE妊娠组。与非PE妊娠相比，PE妊娠与分娩孕周（GAD）降低和新生儿出生体重（NBW）较低相关。为评估TP53BP2在胎盘功能障碍中的意义，分析了胎盘中TP53BP2与LC3B-II和p62的相关性。结果显示，在PE和非PE妊娠中，TP53BP2与LC3B-II水平呈正相关，与p62呈负相关。此外，胎盘TP53BP2水平与SBP、DBP和BMI呈正相关，与GAD和NBW呈负相关。ROC分析表明，TP53BP2诊断PE妊娠的曲线下面积（AUC）值最高，为0.882。因此，这些结果提示TP53BP2可能是与PE妊娠临床病理特征相关的预测性生物标志物。
3.5 DNMT1介导的DNA甲基化抑制TP53BP2转录
首先，研究人员利用UCSC数据库分析TP53BP2启动子的基因组序列，以评估表观遗传调控对其表达的影响。正如预期，TP53BP2启动子的CpG岛含有高比例的GC碱基。MethPrimer程序识别出一个长1240 bp的单一CpG岛，该岛横跨转录起始位点-599至+641位置，CG含量为50%，CpG比率为0.6，位于TP53BP2的5′侧翼区域远端，可能通过甲基化调控TP53BP2水平。
随后，将TP53BP2的5′侧翼区域的几个片段插入荧光素酶载体pGL3中，荧光素酶活性测定结果显示，片段-599/-35（涵盖TP53BP2启动子大部分CpG二核苷酸）表现出最高的启动子活性。一致地，荧光素酶测定显示，转染含有片段-599/-35的pGL3荧光素酶报告基因后，HTR8/SVneo和JEG-3细胞中TP53BP2的转录活性增加，表明该区域是TP53BP2的核心调控区域。
为检验DNA甲基化是否直接抑制TP53BP2启动子活性，研究人员从-599/-35克隆了TP53BP2近端启动子区域。使用甲基化酶SssI (M.SssI)、HhaI (M.HhaI)和HpaII (M.HpaII)对克隆的插入片段进行甲基化。SssI用于甲基化所有51个5′-CpG-3′序列内的CpG位点，HhaI仅甲基化9个5′-GCGC-3′序列内的CpG位点，HpaII甲基化3个5′-CCGG-3′序列内的CpG位点。通过用限制性内切酶McrBC（甲基化特异性限制酶）、HhaI和HpaII（甲基化敏感限制酶）消化证实了片段的正确甲基化。将荧光素酶报告载体转染滋养细胞后的荧光素酶测定显示，三种甲基化酶处理均降低了TP53BP2启动子活性，其中SssI甲基化酶的抑制作用最显著。
接下来，使用MSP检测TP53BP2 DNA甲基化水平的差异。结果显示，PE孕妇胎盘和缺氧条件下的滋养细胞中全局DNA甲基化水平降低。BSP进一步显示，在缺氧条件下，HTR8/SVneo细胞中TP53BP2启动子-599/-35区域内的DNA甲基化水平显著降低。这些结果表明，DNA低甲基化调控了PE妊娠胎盘滋养细胞中TP53BP2的转录激活。
为确定参与DNA甲基化的关键酶，研究人员在缺氧条件下用DC_05（DNMT1抑制剂）、茶黄素-3,3′-双没食子酸酯（TFD；DNMT3a抑制剂）或纳米霉素A（NA；DNMT3b抑制剂）处理HTR8/SVneo细胞。结果显示，DC_05处理（而非TFD或NA）导致缺氧条件下HTR8/SVneo细胞中TP53BP2启动子的DNA甲基化水平显著降低。为进一步确认DNMT1在调控TP53BP2 DNA甲基化中的作用，研究人员通过转导三种独立的sh-DNMT1构建体构建了DNMT1敲低的HTR8/SVneo细胞。结果显示，转导sh-DNMT1 (#1)后，DNMT1的mRNA和蛋白表达显著降低。结果表明，DNMT1敲低降低了TP53BP2启动子的DNA甲基化水平，并增加了TP53BP2的转录活性和蛋白水平。这些结果提示，DNMT1介导的DNA甲基化强烈抑制TP53BP2表达。
3.6 DNMT1通过反向调控E2F1抑制TP53BP2表达
据报道，TP53BP2是E2F1的直接靶标。本研究中，qRT-PCR和Western blotting检测显示，与非PE孕妇相比，E2F1在PE孕妇胎盘中的水平显著增加。免疫荧光染色进一步证实了这一发现。接下来，研究人员通过构建E2F1过表达或敲低来检测E2F1对TP53BP2表达的影响。结果显示，转染Ad-E2F1后，E2F1的mRNA和蛋白水平显著增加。在三种独立的sh-E2F1构建体中，sh-E2F1 (#3)在HTR8/Svneo细胞中表现出最高的敲低效率。E2F1过表达和敲低分别增加和抑制了缺氧条件下HTR8/SVneo细胞中TP53BP2的表达。
此外，使用抗E2F1抗体的ChIP assay显示，在缺氧条件下，E2F1在TP53BP2启动子处显著富集。接下来，研究人员使用JASPAR数据库计算TP53BP2启动子中低甲基化CpG位点周围的推定转录因子结合元件。在TP53BP2启动子中鉴定出三个推定的E2F1结合位点（-33/-22, -99/-88, 和 -368/-357）。ChIP assay显示E2F1与TP53BP2启动子在-33/-22, -99/-88, 和 -368/-357位点显著结合。此外，荧光素酶报告基因测定显示，突变-33/-22 (Mut1), -99/-88 (Mut2), 和 -368/-357 (Mut3)位点后，TP53BP2启动子的活性显著降低。
甲基转移酶可通过直接与转录因子相互作用调控靶基因表达。采用CoIP方法研究DNMT1与E2F1之间的关系。与先前报道一致，DNMT1在缺氧条件下的滋养细胞中与E2F1发生物理相互作用。此外，ChIP assay进一步显示，DNMT1敲低增加了E2F1在TP53BP2启动子处的富集。该结果表明DNMT1介导了E2F1与TP53BP2启动子的结合。总之，这些结果提示DNMT1抑制E2F1与TP53BP2启动子的结合，导致缺氧条件下滋养细胞自噬减少。
3.7 G9a介导的组蛋白甲基化抑制滋养细胞中TP53BP2转录
组蛋白修饰在调控基因转录中起重要作用。本研究利用UCSC基因组浏览器中的ENCODE组蛋白修饰轨道，鉴定了TP53BP2启动子区域的七种组蛋白修饰（H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me2, H3K9me3, H3K27me3 和 H3K36me3）。在这些组蛋白修饰中，H3K4me2和H3K4me3显示出最多的富集峰。使用ChIP assay，研究人员检测到在缺氧条件下，HTR8/SVneo细胞中H3K9me2在TP53BP2启动子处的富集显著减少，而其他组蛋白修饰无此变化。免疫荧光染色显示PE孕妇胎盘滋养细胞中H3K9me2水平显著降低。该结果证实了H3K9me2在PE妊娠滋养细胞TP53BP2转录中的重要性。
此外，通过测量几种广泛认可的组蛋白甲基转移酶（包括G9a、LSD1、SUV39H1和SUV39H2）的水平，研究人员检测到PE孕妇胎盘和缺氧条件下的HTR8/SVneo细胞中G9a水平显著降低。接下来，研究人员通过建立G9a敲低的HTR8/Svneo细胞来研究G9a对TP53BP2表达的影响。在三种独立的sh-G9a构建体中，sh-G9a (#3)在HTR8/Svneo细胞中表现出最高的敲低效率。体外实验显示，G9a敲低显著增强了缺氧条件下HTR8/Svneo细胞中TP53BP2的转录。类似地，用BIX-01294（G9a特异性抑制剂）处理增加了缺氧条件下HTR8/SVneo细胞中TP53BP2的水平。这些数据证明G9a可以抑制PE妊娠患者胎盘中TP53BP2的表达。
3.8 G9a和DNMT1协同抑制E2F1与TP53BP2的结合
为阐明DNMT1和G9a在调控TP53BP2表达中的潜在关系，研究人员通过转染Ad-DNMT1和/或Ad-G9a在HTR8/SVneo细胞中过表达DNMT1或G9a。DNMT1或G9a表达降低了E2F1与TP53BP2启动子的结合，而DNMT1和G9a共过表达进一步减弱了这种结合。此外，G9a和DNMT1敲低显著降低了缺氧条件下HTR8/SVneo细胞中TP53BP2的DNA甲基化水平和H3K9me2在TP53BP2启动子处的富集，最终导致TP53BP2转录和蛋白表达显著上调。在缺氧条件下用DC_05和/或BIX处理的HTR8/SVneo细胞中也观察到类似结果。
值得注意的是，将AAV-shG9a和/或AAV-shDNMT1注射到PE大鼠胎盘后，H&E染色显示胎盘损伤显著增加。此外，注射AAV-shG9a和/或AAV-shDNMT1的PE大鼠显示血压和尿蛋白水平显著升高，提示G9a和DNMT1在胎盘功能障碍中对E2F1与TP53BP2启动子结合的协同抑制作用。
接下来，研究人员研究了滋养细胞中E2F1、DNMT1和G9a之间的相互作用。CoIP assay显示，在缺氧条件下，DNMT1与G9a和E2F1发生物理相互作用，而G9a与E2F1之间几乎无相互作用。免疫荧光染色显示，DNMT1和G9a与E2F1在HTR8/SVneo细胞核中共定位。
考虑到DNMT1的多功能结构域，研究人员构建了一系列DNMT1的截短构建体，并将编码不同GST标记的DNMT1片段（GST-control, GST-WT, GST-1-446, GST-431-703, GST-643-835, GST-836-1060, 和 GST-1061-1632）的质粒与编码Myc标记的G9a（Myc-G9a）或Flag标记的E2F1（Flag-E2F1）的质粒共转染到HEK293细胞中。CoIP assay显示，DNMT1的1–446区域与G9a相互作用，而DNMT1的1061–1632区域与E2F1相互作用。
最重要的是，荧光素酶报告基因测定显示，转染Δ1–446突变的HTR8/SVneo细胞中TP53BP2转录活性显著增加，而转染Δ1061–1632突变则降低了其转录活性。此外，构建了缺失与G9a（Δ1–446）或E2F1（Δ1061–1632）相互作用区域的DNMT1质粒，并将其转染到HTR8/SVneo细胞中。有趣的是，删除DNMT1的1–446区域显著增加了缺氧条件下HTR8/SVneo细胞中E2F1在TP53BP2启动子处的富集，同时减少了DNMT1在TP53BP2启动子处的富集。相反，删除DNMT1的1061–1632区域促进了E2F1与TP53BP2启动子的结合，并增强了H3K9me2的富集。总之，这些结果表明G9a与DNMT1之间的相互作用抑制了E2F1介导的滋养细胞中TP53BP2的激活。
4 讨论
子痫前期（PE）是导致孕产妇和胎儿发病的主要原因，其病理与胎盘功能障碍和
