《Advanced Science》：SIRT5–RAC2 Axis Drives Monocyte-to-Macrophage Differentiation to Promote Inflammatory Injury in Premature Ovarian Insufficiency
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本文揭示了SIRT5通过调控RAC2蛋白稳定性促进单核细胞向巨噬细胞分化的新机制，阐明了SIRT5–RAC2轴在卵巢免疫微环境稳态中的关键作用。研究发现SIRT5缺失可减轻环磷酰胺（CTX）诱导的卵巢巨噬细胞浸润和颗粒细胞凋亡，为卵巢早衰（POI）的免疫治疗提供了新靶点。
2.1 SIRT5缺陷减少卵巢巨噬细胞浸润
为研究POI发病过程中卵巢微环境的免疫紊乱，研究团队首先建立了化疗诱导的POI模型。8周龄雌性小鼠腹腔注射环磷酰胺（CTX，50 mg/kg）后，卵巢出现明显功能障碍，表现为卵巢重量和卵泡储备显著减少，同时伴随广泛卵泡闭锁。qRT-PCR分析显示CTX处理显著下调了卵泡发育关键调节因子（包括颗粒细胞特异性基因Amh、Foxl2、Fshr以及卵母细胞特异性基因Gdf9），表明卵泡发育受损。同时，负责雌激素生物合成的颗粒细胞特异性酶Cyp19a1表达显著降低，提示类固醇生成功能受损。
通过检测免疫细胞标志物表达，研究发现CTX处理的卵巢中巨噬细胞标志物Adgre1和Cd68显著上调，而T细胞、浆细胞和树突状细胞标志物仅轻微增加。流式细胞术分析和免疫荧光染色进一步证实巨噬细胞是CTX处理卵巢中最显著扩张的免疫群体。
对成人小鼠卵巢scRNA-seq数据的分析发现，Sirt5表达在卵巢巨噬细胞和黄体细胞中高度富集，而在卵母细胞中表达可忽略不计。免疫荧光染色验证了SIRT5在F4/80+巨噬细胞中的强表达，这些巨噬细胞主要分布在AMH阳性发育卵泡周围的卵巢间质中。
2.2 SIRT5缺陷破坏卵巢单核-巨噬细胞分化
为表征SIRT5缺失后卵巢巨噬细胞的分子和功能变化，研究团队对从对照和Sirt5?/?卵巢中FACS分选的F4/80+CD11b+巨噬细胞进行了Smart-seq分析。基因集富集分析显示，在Sirt5?/?卵巢巨噬细胞中下调的基因显著富集于M-CSF刺激下单核-巨噬细胞分化过程中诱导的转录本。
为评估SIRT5在CSF1诱导的巨噬细胞分化中的功能作用，研究使用了两种体外模型。在两种模型中，单核-巨噬细胞分化过程中Sirt5mRNA水平均显著上调。SIRT5缺失显著损害了巨噬细胞分化，表现为经典巨噬细胞标志物转录减少。免疫荧光进一步证实CSF1处理后，Sirt5?/?单核细胞来源群体中F4/80+细胞比例降低。
2.3 SIRT5通过增强CSF1R信号促进单核-巨噬细胞分化
机制探索发现，CSF1诱导的JAK2和AKT磷酸化在Sirt5?/?单核细胞中显著降低。与体外发现一致，在巨噬细胞群体重建过程中，SIRT5缺陷单核细胞也表现出JAK/STAT和AKT信号激活受损。这些数据表明SIRT5通过维持JAK/STAT和PI3K/AKT信号传导，对CSF1驱动的卵巢微环境内巨噬细胞分化是必需的。
2.4 SIRT5促进卵巢微环境炎症
为评估SIRT5缺陷引起的单核-巨噬细胞分化受损如何影响卵巢免疫稳态，研究团队分析了Sirt5+/+和Sirt5?/?卵巢的RNA测序数据。基因本体和通路富集分析显示差异表达基因显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。RNA测序和qRT-PCR验证均表明SIRT5缺陷显著降低了多种巨噬细胞来源的细胞因子和趋化因子的mRNA表达，主要是促炎因子如Tnf、Il1b、Il1a、Cxcl9和Cxcl10。
2.5 SIRT5缺陷减轻CTX诱导的卵巢功能障碍
在CTX诱导的POI模型中，CTX暴露引起了单核细胞来源巨噬细胞（Ly6C+F4/80+）的显著扩张。CTX处理还诱导了卵巢间质中M1样巨噬细胞的强烈增加，而M2样巨噬细胞丰度基本不变。小鼠血清和卵巢组织的ELISA检测显示CTX处理显著升高了促炎细胞因子TNF-α和IL-1β水平，卵巢组织中的积累高于循环系统。
值得注意的是，SIRT5缺陷显著减轻了CTX诱导的卵巢单核细胞来源巨噬细胞扩张，导致M1巨噬细胞积累减少，TNF-α和IL-1β在转录和蛋白水平表达降低。形态学上，SIRT5缺失也减轻了CTX诱导的卵巢重量损失，并部分保留了卵泡池。
2.6 SIRT5缺陷减轻 caspase依赖性颗粒细胞凋亡
免疫组化分析显示，生长卵泡中Ki67阳性颗粒细胞减少，CTX处理的卵巢中cleaved Caspase-3染色显著增加，表明颗粒细胞增殖减少和凋亡增强。TUNEL和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测进一步证实了这些发现。这些病理变化在CTX处理的SIRT5缺陷卵巢中显著减轻，表明SIRT5缺陷减轻了CTX诱导的颗粒细胞凋亡和衰老，从而保护卵泡完整性。
2.7 SIRT5通过去琥珀酰化稳定RAC2促进单核-巨噬细胞分化
研究发现SIRT5缺陷或抑制其去琥珀酰酶活性导致RAC2蛋白水平显著降低，而Rac2mRNA表达没有相应下降。免疫共沉淀和质谱分析鉴定RAC2为SIRT5的新型琥珀酰化底物。SIRT5缺陷导致RAC2琥珀酰化增加，促进其蛋白酶体降解，从而损害CSF1R驱动的巨噬细胞分化。
2.8 MC3482药理抑制SIRT5减轻CTX诱导的POI模型卵巢损伤
MC3482（SIRT5抑制剂）处理显著改善了卵巢结构，保留了卵泡池，表现为静息卵泡和生长卵泡数量增加，卵泡闭锁减少。基因表达分析显示MC3482处理恢复了卵泡发育和类固醇激素生物合成的关键调节因子，同时降低了凋亡和氧化应激相关基因的表达。MC3482处理还显著抑制了CTX诱导的卵巢巨噬细胞群体扩张，降低了TNF-α和IL-1β在蛋白和mRNA水平的表达。
研究表明SIRT5–RAC2轴是卵巢免疫微环境的关键调节因子，SIRT5通过去琥珀酰化稳定RAC2蛋白，确保CSF1信号传导的有效转导，从而促进单核-巨噬细胞分化。在化疗诱导的卵巢损伤中，抑制SIRT5–RAC2轴可减轻巨噬细胞驱动的炎症和颗粒细胞凋亡，为卵巢早衰的治疗提供了新的潜在靶点。
