基于POLD4基因编辑的CRISPR-Cas9-MRI诊疗一体化脂质体增强前列腺癌放射敏感性研究

《Advanced Science》：CRISPR-Cas9-Loaded Theranostic Liposomes for Enhancing Radiosensitization of Prostate Cancer through POLD4 Gene Editing under Real-Time MRI Monitoring

本文报道了一种新型诊疗一体化基因递送平台（PIO@Lipo），通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑前列腺癌中DNA聚合酶δ亚基4（POLD4）基因，并在超小型超顺磁性氧化铁纳米颗粒（USPIONs）介导的磁共振成像（MRI）实时监测下，有效增强肿瘤放射敏感性。研究证实PIO@Lipo可诱导DNA损伤、促进细胞凋亡并重塑免疫抑制微环境，为克服前列腺癌放射抵抗提供了新策略。

　　

探索新的放射增敏基因靶点

放射治疗是局部进展性前列腺癌的基础治疗手段，但其疗效常因DNA修复机制等因素介导的放射抵抗而受限。本研究通过对接受6 Gy照射的前列腺癌RM-1细胞进行转录组测序分析，鉴定出2969个差异表达基因（DEGs）。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些基因显著富集于细胞周期调控和DNA修复通路，包括错配修复、同源重组修复等。值得注意的是，DNA聚合酶δ亚基4（POLD4）作为这些通路的共同调控组分，其表达在放疗后显著上调。生物信息学分析进一步证实POLD4在前列腺癌组织中的表达高于癌旁正常组织。POLD4是DNA聚合酶δ复合体的关键亚基，在DNA复制和修复中起核心作用。研究表明，POLD4敲低可增强淋巴瘤细胞对化疗药物喜树碱的敏感性，且不影响正常细胞活力，提示其作为放射增敏靶点的潜力。

质粒与USPIONs共载脂质体的表征

为验证POLD4的放射增敏作用，研究构建了五个靶向POLD4的CRISPR-Cas9质粒，并筛选出编辑效率最高的sgRNA3用于后续实验。通过静电相互作用，将CRISPR-Cas9质粒和USPIONs共同封装于阳离子脂质体中，形成MRI可追踪的基因递送平台（PIO@Lipo）。琼脂糖凝胶阻滞实验证实质粒在1:1质量比下被完全包裹，封装效率达91.8%。动态光散射（DLS）显示PIO@Lipo的水合粒径为72.1–94.8 nm，多分散指数（PDI）为0.20–0.25。空脂质体（Lipo）的zeta电位为42.2 mV，负载USPIONs（IO@Lipo）后降至21.9 mV，进一步负载质粒（PIO@Lipo）后为15.4 mV。X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了USPIONs的成功掺入。透射电子显微镜（TEM）显示USPIONs平均粒径为4.5 ± 0.8 nm，PIO@Lipo呈膜结构形态，平均直径72.9 nm，适于通过增强渗透和滞留（EPR）效应实现肿瘤靶向。脂质体组成中DSPE-PEG-NH₂的比例调整为3%，以增强体内稳定性和抗污能力。

PIO@Lipo通过抑制肿瘤生长和诱导凋亡增强放疗疗效

细胞实验分为六组：对照组（G1）、空脂质体组（G2）、IO@Lipo组（G3）、PIO@Lipo组（G4）、放疗组（G5）及PIO@Lipo联合放疗组（G6）。CCK-8实验显示，PIO@Lipo在12 μg/mL浓度下将细胞活力降至45%。集落形成实验表明，联合治疗组（G6）的集落数显著减少至81个，呈现协同抗肿瘤效应。活/死染色和流式细胞术凋亡分析进一步证实，G6组晚期凋亡细胞比例达33.7%，显著高于其他组。Western blot结果显示，联合治疗组DNA损伤标志物γ-H2AX表达上调，促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，表明线粒体凋亡通路被激活。qPCR结果在mRNA水平验证了Bax和Bcl-2的表达变化。为确认POLD4的放射增敏作用，研究还构建了sgRNA抗性POLD4 cDNA质粒，发现恢复POLD4表达可减弱放射增敏效应，进一步证实POLD4是有效的放射增敏靶点。机制上，POLD4缺失导致复制叉崩溃，与放疗引起的DNA断裂协同作用，加剧基因组不稳定性。

PIO@Lipo的转染效率及其对基因编辑通路的影响

通过质粒携带的EGFP报告基因评估转染效率，共聚焦显微镜和流式细胞术显示PIO@Lipo的转染效率达49.2%，体内肿瘤组织转染效率为14.9%。Sanger测序证实PIO@Lipo介导的POLD4基因编辑在体外细胞和体内肿瘤组织中均诱导了序列变异，Indel频率分别为28%和10%。Western blot和qPCR分析显示，联合治疗组POLD4表达显著下调，同时ATM-CHK2通路活化，同源重组修复蛋白RAD51表达上调，表明DNA损伤反应被激活。溶酶体逃逸实验显示，PIO@Lipo在4小时部分共定位溶酶体，8小时后质粒成功进入细胞核。为评估脱靶效应，研究通过Cas-OFFinder工具预测了前6个潜在脱靶位点，Sanger测序和扩增子测序均未检测到脱靶编辑，证实了CRISPR系统的高特异性。

PIO@Lipo的MRI性能及体内时间依赖性分布

体外MRI显示PIO@Lipo在T1加权成像（T1WI）和T2加权成像（T2WI）中均具有对比增强能力，纵向弛豫率（r₁）为2.8 mM^-1s^-1，横向弛豫率（r₂）为35.7 mM^-1s^-1。尾静脉注射后，肿瘤部位在1小时出现明显信号增强，4小时达到峰值，12小时基本恢复至基线水平。小动物活体成像系统（IVIS）和电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP-OES）定量分析表明，PIO@Lipo在肿瘤组织中积累显著高于游离质粒，4小时达到峰值，随后逐渐被肝脏和脾脏清除。其高效肿瘤靶向归因于适中的粒径（~73 nm）、3%的PEG化修饰以及EPR效应。

PIO@Lipo的治疗效果评估

动物实验显示，联合治疗组（G6）肿瘤体积显著减小，小鼠体重稳定增加。Western blot证实肿瘤组织中POLD4表达下调，RAD51表达上调。肿瘤大体标本显示G6组肿瘤颜色苍白，提示血管生成抑制。组织病理学分析显示，G6组Ki-67阳性细胞减少，HE染色见核固缩和碎片化，TUNEL检测到大量凋亡细胞。这些结果表明PIO@Lipo联合放疗可有效抑制肿瘤增殖并诱导细胞凋亡。

PIO@Lipo介导的放疗免疫调节及生物相容性

流式细胞术分析显示，联合治疗组脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞比例显著增加，肿瘤组织中M1型巨噬细胞（CD80⁺）比例上升，M2型巨噬细胞（CD206⁺）比例下降。ELISA检测发现肿瘤组织内TNF-α、IFN-β和IFN-γ等抗肿瘤细胞因子水平升高，表明联合治疗诱导了免疫原性细胞死亡（ICD），并重塑了肿瘤微环境。血液生化指标和主要器官组织学检查未发现明显毒性，证实PIO@Lipo具有良好的生物相容性。

结论

本研究开发了一种MRI监控的基因治疗平台PIO@Lipo，通过CRISPR-Cas9系统靶向敲低POLD4基因，显著增强了前列腺癌的放射敏感性。机制上，PIO@Lipo诱导DNA损伤、促进凋亡并调节免疫微环境。该策略为克服前列腺癌放射抵抗提供了新的治疗思路。